美国药典微生物检测精要

美国药典微生物检测精要培训小结一微生物实验室规范重要的控制点：无菌技术、培养基控制、菌种控制、设备操作与控制、数据记录与实验室布局和运作、员工培训等。1无菌技术：防止和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作方法和管理方法。可通过无菌环境、灭菌、消毒、卫生要求、无菌操作技术等手段来实现。2培养基：是微生物实验工作的核心。包括培养基制备、培养基储存、培养基质量控制。2.1培养基制备2.1.1根据既定的目的选用正确的培养基2.1.2参考生产商的ＣＯＡ和说明书：关于配制、储存和菌种选用等。2.1.3所用的水应为去离子水或蒸馏水，应记录用量。2.1.4成分的称量应用校准过的天平，根据称量量的不同选择合适的天平。使用清洁的容器和工具（1051玻璃器皿清洁）以防外来污染和抑制剂。应记录称量量。2.1.5加热帮助溶解时应防止过度加热，通常培养基颜色变深说明加热过度了。2.1.6灭菌条件：灭菌参数应验证，验证应同时考虑无菌和培养基生长能力采用高压蒸汽灭菌或过滤灭菌。湿热灭菌应考虑装载分布，加热速度过慢会使培养基过度加热，通常为121℃15min，此时间是指培养基温度达到121℃后15min。保证最低SAL，在无菌和过度加热之间平衡。与污染物分开灭菌消毒结束后，不应在灭菌柜中储存培养基，过度加热会影响培养基颜色、澄清、pH和凝固能力。2.2培养基储存2.2.1制备培养基的储存琼脂培养基易受冷冻影响，低于0℃会破坏凝胶结构。应避光避热，密封防止水分蒸发（建议使用螺旋盖的瓶子密封，保存时间长）。2.2.2培养基融化不能超过一次，以防过度加热或潜在污染。融化可采用水浴、流通蒸汽或微波炉加热。微波炉加热宜采用少量多次，以防过度。培养基融化后在40-50℃水浴中储存不应超过8小时，浇制平皿前应擦干以防污染。2.2.3培养基标示培养基名称批号、制备批号制备日期、有效期2.2.4有效期确定根据成分、配方、容器、储存条件等确定有生长能力试验数据支持2.2.5应在验证过的条件下储存2.2.6重要区域环控用培养基必须双层包装最终灭菌，否则进行全数培养及用前检查2.2.7根据当地生物危险品安全程序处置过期培养基2.3培养基质控2.3.1灭菌后培养基检查2.3.1.1生长能力每批制备的培养基均需进行测试菌种根据药典，供应商说明书及环境中分离得到测试不合格应进行调查，如无原因，或无有效纠正措施，不得使用该批号2.3.1.2无菌2.3.1.3pH2.3.1.4容器/平皿的完整性2.3.1.5抑制或指示能力2.3.2定期稳定性检查以确认储存有效期3菌种保藏3.1建立标准程序处理、保存菌种，防止污染和特性变化3.2使用前确认菌种身份和纯度3.3根据生产商说明书复苏菌种，使用接种技术3.4-70℃以下或冷冻干燥保存储备菌种，可延长保存周期3.5开启后不要重新冷冻菌种，剩余部分应弃置3.6传代次数（每接种一次即为一代）不超过5次3.7保藏时间根据具体保藏条件确定4设备维护4.1定期校准、保养4.2定期性能检查4.3定期清洁、消毒5实验室布局和运作5.1防止交叉污染5.2活动分区：无菌、环控样品的处理和培养应在无菌环境中进行5.3当发现微生物生长，后续的工作应转移至“阳性”区5.4环控设备应放置在待取样区域环境中并小心操作5.5应在受控条件下小心取样6样品处理6.1大部分样品、水或环控样品中的微生物对操作、储存环境敏感6.2减少样品，取样与测试间的时间间隔6.3长时间的转移需确认转移条件对测试及样品的影响6.4在无菌条件下，使用无菌技术取样，即使是非无菌样品6.5取样记录：样品信息、取样日期、送样日期、人员/部门、实验室样品接受及确认7培养基培养时间7.1短于3天，用小时表示7.2长于3天，用天表示（上午、下午，相同时间段）8人员培训8.1每个岗位应有相应培训要求，进行上岗前资质确认9实验室文件9.1微生物人员培训和能力确认（上岗资质）9.2设备验证、校准和维护9.3测试中的设备性能（如温度记录）9.4培养基制备、无菌检查、生长能力测试、选择性测试9.5培养基清单与控制9.6根据程序（ＳＯＰ）进行测试的重要数据9.7数据和计算的确认9.8经ＱＡ人员或相应领导审核过的报告9.9超标结果调查10实验室结果维护10.1检测报告至少应包括：日期测试样品微生物检验人员名字程序编号测试结果偏差（如有）测试参数（设备、菌种、培养基）管理人员审核签名10.2数据纠错：错误的地方划一横线，签名和日期，必要时说明原因10.3测试结果应包含平皿计数结果（如有）数据分析方法应罗列在相关ＳＯＰ中对粘贴的图表、数据骑缝签名10.4存档：记录应存档并防止丢失，应有记录留存计划11测试结果解释11.1微生物数据有时不容易解释与人类相关的微生物群落被广泛的用于许多测试人员污染是始终被关心的问题样品或环境中的微生物并非均匀分布微生物检测可变范围大：可能在+/-0.5log10单位左右11.2不符合的结果可能是由2个原因造成的：实验室错误或产品不符合。无论哪种情况，管理层必须立即被通知11.3调查应包括：数据偏离的程度（严重性）平行数据间差异的评估实验室环境取样方法物料特性（存活的污染微生物）人员面谈留样评估测试过程11.4纠偏计划（警戒限、行动限）如果发现实验室错误，需要纠偏措施的有效性需要跟踪和记录11.5无效测试：由于错误将试验视作无效必须记录11.6确认测试（复试）：应有ＳＯＰ描述何时进行二非无菌产品：微生物计数1常规过程1.1避免产品以外的微生物的污染。1.2去除细菌抑制/真菌抑制性。1.3证明表面活性剂的无毒性及其与抑制剂的相容性。2计数方法2.1薄膜过滤法2.2平皿计数法：平皿浇注法，表面涂布法。2.3最大可能性数量法（MPN）：用于检测极少数量的微生物，精密度、准确度差，不适合用于霉菌。3生长能力测试和方法适用性3.1生长能力测试：一般考虑测试菌株准备缓冲液阴性对照培养基生长测试3.2计数方法适用性：样品制备接种与稀释中和/去除抗菌活性产品存在情况下的微生物的回收率结果与解释4微生物数据的可变性4.1成品测试4.1.1抗菌效力测试4.1.2微生物限度检查4.2培养基生长能力测试固体培养基，计数结果与标准接种物的计数数量差别小于系数2。对新鲜制备的菌液，生长与前批已通过的培养基的前次测试结果一致。4.3计数方法适用性测试样品计数结果与对照计数结果的相差小于系数2。4.4微生物回收率验证4.4.1固体培养基的回收率验证4.4.2受损微生物的恢复三非无菌产品：控制菌微生物测试1常规过程1.1避免产品以外的微生物的污染。1.2去除细菌抑制/真菌抑制性。2产品测试2.1样品制备和增殖2.2选择性培养2.3结果解释3培养基适用性测试和方法适用性测试3.1培养基适用性测试：测试菌株准备菌株阴性对照生长能力测试、抑制及选择性测试3.2方法适用性：样品制备接种与稀释中和/去除抗菌活性产品存在的情况下，微生物的回收率结果与解释4菌种金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌大肠埃希菌肠道沙门氏菌白色念珠菌梭菌4.1微生物使用不超过5代4.2PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液或PH7.2磷酸盐缓冲液制备悬浮菌液4.3悬浮菌液2小时内使用，2-8℃不超过24小时4.4生孢梭菌也可制备孢子悬浮液，2-8℃保存期限需确认四药物制剂和药用物质的接受标准1非无菌制剂的微生物质量标准1.1口服固体1.2口服液体1.3直肠制剂1.4局部及鼻腔制剂1.5阴道制剂1.6吸入剂1.7活性药物成分、辅料2药物产品的接受标准2.1其他重要性根据评估：产品用途产品特点应用的方法药物接受者：对婴儿、幼儿及衰弱患者的风险是不同的存在疾病、伤口、器官损伤相应的因素的风险评估由经授权的有资质的人员进行3有害微生物3.1有害微生物的概念不适合无菌产品，无菌产品中不得有任何微生物3.2将用于非无菌产品的微生物测试，及非无菌产品环境中分离到的微生物评估及清洁验证3.3有害微生物的定义：3.1.1能在产品中增殖的微生物，对药品的物理特性及治疗作用有负面影响3.1.2由于产品中微生物的数量及致病性能导致使用该药品的患者受到感染4微生物质量相关的产品召回5USP微生物质量接受标准5.1USP各论要求是最低的公共标准5.2通则提供了符合各论要求的方法5.3有效期内测试5.4不等于成品所需的所有放行测试五水分活性确定对非无菌药品的应用1水分活性1.1非无菌药物制剂中水分活性的确定：1.1.1改善产品处方以提高防腐系统的抗菌效力1.1.2降低可能在产品处方中化学水解的活性成分的降解1.1.3降低微生物对产品的污染1.1.4可以减少和如何筛选需测试的控制菌1.2降低水分活性在微生物生长方面的作用1.2.1较长的停滞期、较慢的生长速度、较少的稳定期的微生物数量1.2.2减少微生物毒素的产生1.2.3在某个微生物专有的水分活性以下，该微生物不会生长1.2.4水分活性下降后，微生物的耐热性会提高2测试策略2.1水分活性高于0.75的多剂量水性药品需要加入防腐剂并将微生物限度测试作为常规放行测试2.2水分活性低于0.75的药品不需额外防腐，在风险评估后不需要将微生物限度测试作为常规放行测试2.3制药厂商对原料厂商的生产工艺、质量计划、测试记录有全面的了解。这些可以通过供应商审计计划得到六无菌测试1灭菌和无菌保证中的观点：按照无菌最严格的定义，只有当样品中完全没有活的微生物时，它才能被称为是无菌的。2无菌测试的首要难点：整批产品不能进行逐个破坏检查是无法证明绝对无菌的。2.1无菌是根据概率的原则判断的。从给定批号的所有产品中存在被污染产品的概率得出判断。2.2目的是使其可能性与真实性仅有可接受的微小差异。3无菌测试本身并不是设计用于保证产品无菌或产品已灭菌。产品的无菌保证是通过灭菌工艺或无菌工艺的验证来得到的。4无菌测试流程4.1培养基和细菌抑制/真菌抑制性测试（方法验证）4.2去除任何抑制细菌和真菌生长的因素4.3确定用于测试的样品数量，每个样品的用量4.4培养样品4.5检查测试样品是否有生长的迹象4.6显微镜检查有疑问的容器是否有生长的迹象4.7必要的话再接种培养4.8写报告5培养基测试5.1培养基的储存2-25℃无菌，密闭容器储存不超过验证过的期限硫乙醇酸盐液体培养基颜色指示要求符合5.2培养基的无菌：每种要求的培养基取一部分在特定温度下培养14天，检查是否浑浊与测试同时进行培养基的无菌检查5.3生长能力测试：在硫乙醇酸盐液体培养基中加入≦100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生饱梭菌在大豆酪蛋白消化培养基中加入≦100cfu的枯草杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌细菌3天、真菌5天检查生长的迹象6方法适用性测试6.1将待测样品内在的细菌抑制性和真菌抑制性去除6.2制备微生物培养的稀释液，最终浓度应使加入产品的微生物数量不超过100cfu6.3根据产品（或各论要求）使用膜过滤法或直接接种法6.3.1膜过滤法：产品特征允许的话，作为首选方法将测试样品滤过，将微生物截留在滤膜上（孔径不大于0.45uM）在最后一步冲洗液中在加入不超过100cfu的微生物将滤膜放入测试用培养基记住对6个微生物，每个都要这样操作（见上述生长能力测试）进行培养基生长能力测试作为阳性对照在适宜温度下培养不超过5天6.3.1.1冲洗：“每个滤器冲洗不要超过100ml5次，即使在验证中显示这样的冲洗还不能完全去除抗菌活性6.3.1.2化学添加物6.3.2直接接种法：将样品加入培养基。样品体积不超过培养基体积的10%。（或配制浓缩培养基）培养基中加入不超过100cfu的微生物记住对6个微生物，每个都要这样操作（见上述生长能力测试）进行培养基生长能力测试作为阳性对照在适宜温度下培养不超过5天7微生物回收率验证7.1当测试方法决定于微生物生长时，去除细菌抑制性或真菌抑制性是很重要的7.2可以使用特殊的中和剂、进行稀释或通过这些不同方法