5 第五讲 分子克隆载体

目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶DNAligase重组体载体自连目的基因自连基因操作的基本步骤载体单独一个包括启动子、编码区和终止子的基因，或者组成基因的某个元件，一般是不易进入受体细胞的，即使采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内维持。载体(vector):能携带外源基因（或DNA片段）进入细胞复制、整合或表达的工具。作为克隆载体的DNA分子具备的条件：1具有对受体细胞的可转移性，能携带外源基因进入宿主细胞；2能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增殖；3具有由单一限制酶识别位点组成的多克隆位点(MCS）；4克隆载体必须具有用于选择克隆子的标记基因；5克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人的细胞。多克隆位点ori复制起始点遗传标记AmprMCS克隆载体按功能分：克隆载体表达载体质粒克隆载体(plasmidcloningvector)质粒(plasmid):是一种寓于宿主细胞中染色体外裸露的dsDNA分子。一个质粒就是一个DNA分子。Plasmidchromosome存在于细菌、真菌、蓝藻和绿藻的细胞中，在细菌细胞中最多。质粒的存在形式：一般以超螺旋共价闭环DNA分子(ccc-DNA)的形式存在。也可以开环DNA分子(oc-DNA)和线性DNA分子(L-DNA)的形式存在。质粒DNA的大小质粒宿主大小（kb）pPbs蓝藻1.5CoLE1大肠杆菌6.4PV21三叶草根瘤菌700多数在10kb左右质粒的基本性质：1复制按照质粒控制拷贝数的程度，可以将质粒分为:1）严谨型质粒(stringentplasmid)拷贝数少，为1～5个2）松散型质粒(relaxedplasmid)拷贝数多，可达10个拷贝以上某种质粒属于严谨型或是松散型的，与宿主有一定的关系。例子：质粒ColE1-K30在大肠杆菌中属于松散型的，在奇异变形杆菌中是严谨型的。一般来说，希望构建的质粒克隆载体是松散型的，所以在构建的克隆载体中应含有松散型的复制起始位点和调控复制拷贝数的基因。2质粒的不相容性(incompatibility):两种质粒在同一宿主细胞中不能共存的现象。亲缘关系密切的不同质粒一般属于不亲和性质粒。野生型质粒与其衍生的重组质粒属于不亲和性质粒。当质粒载体承载目的基因转化受体细胞时，考虑受体细胞内原有的质粒与作为克隆载体的质粒是否属于亲和性质粒。作为受体细胞最好不含内源质粒。3质粒的转移性接合型质粒(conjugativeplasmid)：转移基因tra：指令宿主细胞产生菌毛、合成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞的结合，使质粒从一个细胞转移到另一个细胞。非接合型质粒(non-conjugativeplasmid)：顺式作用元件：bom位点移动基因：mob基因(分子质量小、拷贝数多、被动迁移)构建质粒载体的基本原则1选择合适的出发质粒必备元件：A复制起始点B选择标记基因C克隆位点D启动子E终止子等等………..构建质粒载体的基本原则2正确获得构建质粒载体克隆元件一般用限制酶切割出发质粒DNA分子，获得含有某种元件的DNA片段。为了获得含某种元件的DNA片段，选用的切割位点既要保证元件完整无缺，又要使DNA片段愈小愈好，尽可能不含或少含不必要的序列，使构建的载体尽可能小。构建质粒载体的基本原则3组装合适的选择标记基因构建供转化大肠杆菌用的质粒载体，可组装蓝/白颜色进行选择的(B-半乳糖苷酶基因)lacz’基因。但构建供转化蓝藻用的质粒载体不能用这个基因。因为蓝藻含有大量的藻蓝蛋白。构建质粒载体的基本原则4选用合适的启动子如果用真核生物基因的启动子作为原核生物表达克隆载体的启动子，其功效下降；原核生物和病毒基因的启动子用作真核生物表达克隆载体的启动子，可保留其原来的功效。构建质粒载体的基本原则5在能达到预期目的的情况下，构建过程要力求简单。构建质粒克隆载体的基本策略1.构建的质粒克隆载体应该是能在转化的受体细胞中进行有效的复制，并作为质粒克隆载体，希望在受体细胞中有较多的拷贝数。2.构建的质粒克隆载体必须含有允许外源DNA片段克隆的位点，并这样的克隆位点应尽可能多。3.构建的质粒克隆载体必须含有供选择克隆子的标记基因。4.构建的质粒克隆载体DNA分子应尽可能小。5.根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种元件，构建成不同用途的质粒克隆载体。质粒的命名用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字母后用两个或三个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称，再加上质粒编号。如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F.Bolivar和R.L.Rodriguez，322为编号。选择标记基因：(用于鉴别目的DNA的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来）(1)氨苄青霉素抗性基因(amprapr)(2)卡那霉素抗性基因(kanrkmr)(3)四环素抗性基因（tcrtetr）(4)氯霉素抗性基因(cmprcmr)(5)新霉素抗性基因（neor）pBR322的大小是4361bp的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。含有24种限制酶的单一识别位点，具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。将质粒pSF124中含ampr基因的DNA片段和质粒pSC101中含tetr基因的DNA片段同含ColE1复制起始点(来源于pMB1、松散型)的DNA片段重组，构建成质粒克隆载体pBR322。pBR322普通型载体pBR322的结构图pBR322BamHISalIHindIIIPstIScaIAmprori(4.36kb)pBR322如何筛选？利用Tetr基因内部的BamHI位点来插入外源DNA片段，可以通过插入失活进行筛选。BamHIG/GATTC经重组DNA分子转化处理的受体菌在不含标记药物tc的琼脂培养基上培养，则含或不含重组DNA分子的受体菌都能长出菌落。然后取菌落的一部分接种在含tc的琼脂培养基上，不会长出菌落的原菌落才是真正在tcr基因区插入外源DNA片段的克隆子。（为什么？）pUC质粒pUC质粒系列是在pBR322基础上改建成的；包括pBR322的ampr基因；缺乏控制拷贝数的rop基因。pUC的主要优点：（1）分子量更小，仅为2686bp，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。（2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZ，可利用-互补原理进行蓝白筛选。（3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成。pUC18pUC19含四个部分：（1）来自pBR322的质粒复制起点（ori）；（2）ampr;（3）大肠杆菌β半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列；（4）多克隆位点（MCS）lacZ`OriAmprMCSBlueWhiteampramprInsertInsertNoinsertLacZ`LacZ`λ噬菌体载体（lambdaphagevector）把感染细菌的病毒称为噬菌体。病毒主要有DNA（或RNA）和外壳蛋白组成。通过感染，病毒颗粒进入宿主细胞。T2噬菌体结构示意图λ噬菌体的性质1λ噬菌体由λDNA和外壳蛋白组成。2在噬菌体中DNA是线性的，全长48502bp，左右各有12个核苷酸组成的5’凸出黏性末端，而且是互补的。5‘GGGCGGCGACCTNN……..NN3’3’NN……..CCCGCCGCTGGA5’把此末端称为COS位点(cohesiveendsite)3其有50个以上基因4有56种限制酶识别位点5生长途径有溶源途径和溶菌途径。溶菌途径：噬菌体感染宿主细胞后，其DNA不插入染色体DNA，经过一段时间的潜伏期，就大量增殖新的病毒颗粒，使宿主细胞破裂，释放的病毒颗粒又感染其他细胞。（左图示）溶源途径：感染宿主细胞后，其DNA与宿主细胞染色体DNA整合，一起复制和传代，无感染其他细胞的能力。（右图示）裂解循环溶源态λ噬菌体的生长途径λ噬菌体的基因组分区左区：Nul基因—J基因之间的基因其产物用于噬菌体DNA的包装和噬菌体颗粒的形成。λ噬菌体的基因组分区中区：J基因右边—gam基因之间的基因溶源状态的发生和维持以及遗传重组所需要的基因。（外源DNA片段的插入）λ噬菌体的基因组分区右区：gam基因右边—Rz基因之间的基因主要用于噬菌体的复制和裂解宿主菌。用λ噬菌体作为克隆载体的依据1它是一种温和噬菌体。2能承载比较大的外源DNA片段。野生型的头部能包装λDNA分子大小75%～105%的DNA片段，约36.4～51kb。3在λDNA分子上有许多限制性酶识别位点。λDNA的限制性核酸内切酶谱（Kb）λ噬菌体载体的构建过程1去除非必须区，建立外源DNA片段的克隆或替换位点；2在λDNA的非必须区内插入选择标记基因cI基因：它的表达使噬菌体进入溶原状态，基因产物活性受到影响会促进噬菌体进入裂解循环。如果外源DNA片段插入基因cI中，将高效地使hfl突变的E.coli进入裂解生长状态。3建立重组λDNA分子的体外包装系统在实验室重组的λDNA分子，必须经过体外包装成噬菌体颗粒后才有效地感染受体细胞。λ噬菌体突变株D-和E-当两个突变株分别感染受体细胞时，两者都可复制λDNA，但不能把复制合成的λDNA包装成噬菌体颗粒。二者蛋白混合，能有效地包装。λ噬菌体的主要类型1插入型载体(insertionvector):通过特定酶切位点允许外源DNA片段插入的载体。外源DNA片段大小0～6kb。2置换型载体(replacementvector):允许外源DNA片段替换非必须DNA片段的载体。外源DNA片段大小9～23kb。插入型载体主要用于cDNA克隆，允许插入的外源DNA片段大小为0～6kb。基因cI内的E.coRI位点作为唯一位点，可以用于外源DNA的插入。主要用于cDNA文库、基因组文库和表达融合蛋白。允许插入的外源DNA片段的大小为0～7.2kb。基因lac5编码区终止密码子之前有一个E.coRI，可以用于外源DNA的插入。置换型载体在填充片段两端有对称分布的MCS，这两个载体的差别是MCS位点的排列位置相反。M13噬菌体载体基因工程中常对单链DNA测序、制备探针或实施定点突变，应用此载体就可以获得单链DNA。黏粒载体(cosmidvector)基本特征：1是质粒的衍生物，是带有cos位点的质粒。2其组成有质粒的复制起点(ColE1)、抗性基因、cos位点、MCS。3大小为5～7kb4能克隆的外源DNA片段最大达40kb。黏粒载体的特点：（1）具有λ噬菌体的特性（但因不含λ噬菌体的全部必需基因，因此不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒）；（2）具有质粒的特性（有质粒复制子及抗菌素基因）；（3）具有高容量的克隆能力（本身仅5-7kb,克隆极限可达40kb左右）；（4）具有与同源序列质粒进行重组的能力。广泛应用于基因组DNA文库的构建。部分柯斯质粒的基本特性人工染色体载体(artificialchromosomevector)人工染色体载体：利用染色体的复制功能来驱动外源DNA片段复制的载体。1酵母人工染色体载体(YAC)2细菌人工染色体载体(BAC)利用酿酒酵母染色体的复制元件构建的载体。复制的必须元件：1自主复制序列(autonomouslyreplicationsequences,ARS)是一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA进行双向复制所必须的信号。2着丝粒（centromere,CEN）有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。3端粒重复序列（telomericrepeat,TEL）用于保护线状DNA不被细胞内的核酸酶降降，以形成稳定的结构。酵母人工染色体载体(YAC)YAC载体的选择标记：①营养缺陷型基因如色氨酸、亮氨酸合成缺陷型基因trp1、leu2和his3②尿嘧啶合成缺陷基因ura3③赭石突变抑制基因sup4赭石突变抑制基因sup4外源DNA片段的装载导致抑制