王镜岩-生物化学-第5章_蛋白质的三维结构

第五章蛋白质的三维结构一、研究蛋白质构象的方法二、稳定蛋白质三维结构的作用力三、多肽主链折叠的空间限制四、二级结构：多肽链折叠的规则方式五、纤维状蛋白质六、超二级结构和结构域七、球状蛋白质与三级结构八、膜蛋白的结构九、蛋白质折叠和结构预测十、亚基缔合和四级结构一、研究蛋白质构象的方法构型和构象构型－－在立体结构中取代原子或基团在空间的取向。涉及共价键的断裂。构象－－取代基团当单键旋转时可能形成不同的立体结构。不涉及共价键的断裂。•（一）X射线衍射法•（二）研究溶液中蛋白质构象的光谱学方法如：紫外差光谱、荧光和荧光偏震、圆二色性、核磁共振（NMR）吸收目前还没有一种工具能够用来直接观察蛋白质分子的原子和基团的排列。至今研究蛋白质的空间结构所取得的成就主要是应用间接的X—射线衍射法取得的。X射线衍射技术与光学显微镜或电子显微镜技术的基本原理是相似的。X射线衍射技术与显微镜技术的主要区别是：第一，光源不是可见光而是波长很短的X射线；其次，经物体散射后的衍射波，得到的是一张衍射图案。衍射图案需要用数学方法进行重组，绘出电子密度图，从中构建出三维分子图象——分子结构模型。X射线衍射法二、稳定蛋白质三维结构的作用力R基团间的相互作用及稳定蛋白质三维构象的作用力a.盐键b.氢键c.疏水键d.范得华力e.二硫键共价键与非共价键•蛋白质分子中的共价键有肽键和二硫键，决定蛋白质分子的化学结构（稳定蛋白质构型的作用力）。是生物大分子分子之间最强的作用力，化学物质（药物、毒物等）可以与生物大分子（受体蛋白或核酸）构成共价键。•而非共价键（又称为次级键或分子间力）决定生物大分子和分子复合物的高级结构即决定构象的作用力，在分子识别中起着关键的作用。共价键和次级键键能对比•肽键•二硫键•离子键•氢键•疏水键•范德华力90kcal/mol3kcal/mol1kcal/mol1kcal/mol0.1kcal/mol这四种键能远小于共价键，称次级键提问：次级键微弱但却是维持蛋白质三级结构中主要的作用力,原因何在?数量巨大氢键是两个极性基团之间的弱键，也就是一个偶极(dipole)的带正电荷的一端被另一偶极带负电荷的一端所吸引形成的键。存在于肽链与肽链之间，亦存在于同一螺旋肽链之中。氢键虽然是弱键，但蛋白质分子中的氢键很多，故对蛋白质分子的构象起着重要的作用。大多数蛋白质采取的折叠策略是使主链肽基之间形成最大数目的分子内氢键（如α-螺旋、β-折叠），同时保持大部分能成氢键的侧链处于蛋白质分子表面，与水相互作用。方向用键角表示，是指X—H与H…Y之间的夹角，一般为180～250。范德华力是分子间的吸引力，这是一种普遍存在的作用力，是一个原子的原子核吸引另一个原子外围电子所产生的作用力。它是一种比较弱的、非特异性的作用力。（静电引力）。包括三种弱的作用力：定向效应:极性基团间诱导效应:极性与非极性基团间分散效应:非极性基团间范德华力非常依赖原子间的距离，只有当两个非键合原子处于一定距离时(当相互靠近到大约0.4～0.6nm(4～6A)时)，才能达到最大。疏水键是蛋白质分子中疏水性较强的一些氨基酸(如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸等)的侧链避开水相自相粘附聚集在一起，形成孔穴，对维持蛋白质分子的稳定性起一定作用。它在维持蛋白质的三级结构方面占有突出的地位。盐健或称离子键，它是正电荷与负电荷之间的一种静电相互作用。生理pH下，Asp、Glu侧链解离成负离子，Ｌys、Arg、His离解成正离子。多数情况下，这些基团分布在球状蛋白质分子的表面，与水分子形成排列有序的水化层。偶尔有少数带相反电荷的侧链在分子的疏水内部形成盐键。二硫键为1个半胱氨酸的SH基与同链或邻链另1个半胱氨酸的SH基氧化连接而成。在二硫键形成之前，蛋白质分子已形成三级结构，二硫键不指导多肽链的折叠，三级结构形成后，二硫键可稳定此构象。主要存在于体外蛋白中，在细胞内，由于有高浓度的还原性物质，所以没有二硫键。三、多肽主链折叠的空间限制多肽主链上只有α碳原子连接的两个键（Cα—N1和Cα-C2）是单键，能自由旋转。•肽键的所有4个原子和与之相连的两个Cα均在同一平面内•C=O与N-H呈反式排列，键长，键角固定•C-N具部分双键性质，不能自由旋转•Cα-N1，Cα-C2单键，可自由旋转（一）酰胺平面与α－碳原子的二面角扭角的定义•由四个原子组成的系统ADBC•A—B与C—D键分别投影在与B—C键相正交的平面上，A—B与C—D间的夹角称为A与D相对于B—C键的扭角。也可看作ABC平面与BCD平面之间的夹角，记号为θ(Ai,Bj,Ck,Dl)或略记为θ(Bj,Ck)•量值为±180°（顺时针旋转为正）环绕Cα—N键旋转的角度为Φ；环绕Cα—C键旋转的角度称Ψ。多肽链的所有可能构象都能用Φ和Ψ这两个构象角来描述，称二面角。当Φ的旋转键Ni-Ciα两侧的Ci-1-Ni和Ciα-Ci呈顺式时，规定Φ=0。当Ψ的旋转键Ciα-Ci两侧的Ni-Ciα和Ci-Ni+1呈顺式时，规定Ψ=0。从Ciα向Ni看，沿顺时针方向旋转Ciα-Ni键所形成的Φ规定为正值，反时针方向旋转为负值；从Ciα向Ci看,Ciα-Ci顺时针Ψ为（+）反时针Ψ为（-）多肽链折叠的空间限制Φ和Ψ同时为0的构象实际不存在，因为两个相邻肽平面上的酰胺基H原子和羰基0原子的接触距离比其范德华半经之和小，空间位阻。因此二面角（Φ、Ψ）所决定的构象能否存在，主要取决于两个相邻肽单位中非键合原子间的接近有无阻碍。Cα上的R基的大小与带电性质影响Φ和Ψ。Ramachandran根据蛋白质中非键合原子间的最小接触距离，确定了哪些成对二面角（Φ、Ψ）所规定的两个相邻肽单位的构象是允许的，哪些是不允许的，并且以Φ为横坐标，以Ψ为纵坐标，在坐标图上标出，该坐标图称拉氏构象图。拉氏构象图由于原子基团之间不利的空间相互作用，肽链构象的范围是很有限的。可允许的φ和ψ值：Ramachandran构象图⑴实线封闭区域一般允许区，非键合原子间的距离大于一般允许距离，此区域内任何二面角确定的构象都是允许的，且构象稳定。⑵虚线封闭区域是最大允许区，非键合原子间的距离介于最小允许距离和一般允许距离之间，立体化学允许，但构象不够稳定。⑶虚线外区域是不允许区，该区域内任何二面角确定的肽链构象，都是不允许的，此构象中非键合原子间距离小于最小允许距离，斥力大，构象极不稳定。对非Gly氨基酸残基，一般允许区占全平面的7.7%，最大允许区占全平面20.3％四、二级结构：多肽链折叠的规则方式驱使蛋白质折叠的主要动力：(1)暴露在溶剂中的疏水基团降低至最少程度。(2)要保持处于伸展状态的多肽链和周围水分子间形成的氢键相互作用的有利能量状态。蛋白质的二级结构(Secondary)是指肽链的主链在空间的排列,或规则的几何走向、旋转及折叠。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。主要有-螺旋、-折叠、-转角、胶原三股螺旋、310螺旋、4.416螺旋、无规卷曲。1.α螺旋的结构在α螺旋中，多肽主链按右手或左手方向盘绕，形成右手螺旋或左手螺旋，相邻的螺圈之间形成链内氢键，构成螺旋的每个Cα都取相同的二面角Φ、Ψ。典型的α螺旋特征：①二面角：Φ=-57°,Ψ=-48°，是一种右手螺旋；②每圈螺旋：3.6个a.a残基，高度：0.54nm;③每个残基绕轴旋转100°，沿轴上升0.15nm；④氨基酸残基侧链向外；（一）-螺旋-helix⑤相邻螺圈之间形成链内氢链，氢键的取向几乎与中心轴平行。⑥肽键上N-H氢与它后面（N端）第四个残基上的C=0氧间形成氢键。这种典型的α螺旋用3.613表示，3.6表示每圈螺旋包括3.6个残基，13表示氢键封闭的环包括13个原子。2.α螺旋的偶极矩和帽化α螺旋中氢键都沿螺旋轴指向同一方向,每一肽键具有由N-H和C=O的极性产生的偶极矩。α螺旋本身也是一个偶极矩。一个n个残基的典型α螺旋含n-4个氢键，螺旋的头4个酰胺氢和最后4个羰基氧不参加螺旋氢键的形成。螺旋末端附近的非极性残基可暴露于溶剂。蛋白质经常通过螺旋帽化给予补偿。帽化就是给末端裸露的N-H和C=O提供氢键配偶体，并折叠蛋白质的其他部分以促成与末端暴露的非极性残基的疏水作用。3.α螺旋的手性蛋白质中的α螺旋几乎都是右手，但在嗜热菌蛋白酶中有很短的一段左手α螺旋，由Asp-Asn-Gly-Gly（226-229）组成（φ+64°、Ψ+42°）。右手螺旋比左手螺旋稳定。由于α螺旋结构是一种不对称的分子结构，因而具有旋光性，原因：（1）α碳原子的不对称性，（2）构象本身的不对称性。天然α螺旋能引起偏振光右旋，利用α螺旋的旋光性，可测定蛋白质或多肽中α螺旋的相对含量，也可用于研究影响α螺旋与无规卷曲这两种构象之间互变的因素。α螺旋的比旋不等于构成其本身的氨基酸比旋的加和，而无规卷曲的肽链比旋则等于所有氨基酸比旋的加和。α螺旋（包括其它二级结构）形成中的协同性：一旦形成一圈α螺旋后，随后逐个残基的加入就会变的更加容易而迅速。4.影响α螺旋形成的因素R侧链的大小和带电性决定了能否形成α螺旋以及形成的α螺旋的稳定性：①多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸残基,(如Lys，或Asp，或Glu)，则由于静电排斥，不能形成链内氢键，从而不能形成稳定的α螺旋。如多聚Lys、多聚Glu。而当这些残基分散存在时，不影响α螺旋稳定。②Gly的Φ角和Ψ角可取较大范围，在肽中连续存在时，使形成α螺旋所需的二面角的机率很小，不易形成α螺旋。丝心蛋白含50%Gly，不形成α—螺旋。③R基大（如Ile）不易形成α螺旋④Pro－Pro中止α螺旋。⑤R基较小，且不带电荷的氨基酸利于α螺旋的形成。如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自发卷曲成α螺旋。5.其他类型的螺旋310－螺旋（n=3，Φ=-49°,Ψ=-26°）π－螺旋（4.416螺旋）27－二重带-螺旋（二）β折叠片两条或多条几乎完全伸展的多肽链（或同一肽链的不同肽段）侧向聚集在一起，相邻肽链主链上的NH和C=0之间形成氢键，这样的多肽构象就是β-折叠片。β-折叠中所有的肽链都参于链间氢键的形成，氢键与肽链的长轴接近垂直。多肽主链呈锯齿状折叠构象，侧链R基交替地分布在片层平面的两侧。-pleatedsheet蛋白质的β-折迭反平行β折叠平行β折叠平行式：所有参与β折叠的肽链的N端在同一方向。φ=-119°Ψ=+113°。反平行式：肽链的极性一顺一倒，N端间隔相同。φ=-139°Ψ=+135°。从能量上看，反平β折叠比平行的更稳定，前者的氢键NH---O几乎在一条直线上，此时氢键最强。在纤维状蛋白质中β折叠主要是反平行式，而在球状蛋白质中反平行和平行两种方式都存在。在纤维状蛋白质的β折叠中，氢键主要是在肽链之间形式，而在球状蛋白质中，β折叠既可在不同肽链间形成，也可在同一肽链的不同部分间形成。（三）β-转角（β-turn）β-转角也称β-回折（reverseturn）、β-弯曲（β-bend）、发夹结构（hair-pinstructure）β-转角是球状蛋白质分子中出现的180°回折，有人称之为发夹结构，由第一个a.a残基的C=O与第四个氨基酸残基的N-H间形成氢键。目前发现的β转角多数在球状蛋白质分子表面，β转角在球状蛋白质中含量十分丰富，占全部残基的1/4。β转角的特征：（这类结构主要存在于球状蛋白分子中）①由多肽链上4个连续的氨基酸残基组成。②主链骨架以180°返回折叠。③第一个a.a残基的C=O与第四个a.a残基的N-H生成氢键。④C1α与C4α之间距离小于0.7nm⑤多数由亲水氨基酸残基组成。Gly缺少侧链，在β转角中能很好地调整其他氨基酸残基的空间阻碍；Pro具有环状结构和固定的ψ角，在一定程度上迫使β转角的形成。-转角的极限形式即为310螺旋（四）无规卷曲没有规律的多肽链主链骨架构象。细胞色素c的三级结构球状蛋白中含量较高，对外界理化因子敏感，与生物活性有关。α-螺旋，β-转角，β-折叠在拉氏图上有固定位置，而无规卷曲的φ、Ψ二面角可存在于所有允许区域内。五、纤维状蛋白质