常规细胞培养相关技术研究

常规细胞培养相关技术研究主要内容细胞体外培养1细胞传代2细胞转染3细胞冻存、复苏4细胞基础研究方法5细胞培养箱细胞培养体外条件37℃，5%CO2细胞培养基DMEMRPMI1640DMEM/F12a-MEM特殊培养基无血清培养基胎牛血清新生牛血清青霉素链霉素庆大霉素细胞培养－无菌操作1.紫外线消毒（如移液器、废液缸、试管架等）2.火焰消毒（培养瓶、瓶盖、离心管、玻璃吸管，镊子）3.75%酒精消毒4.废液的处理细胞培养最大的问题－细胞污染细菌污染真菌污染细胞污染是新手最容易遇到的问题，如何解决？细胞观察肉眼观察培养液颜色及混浊度倒置显微镜观察细胞生长状态体外培养细胞的分型（一）贴附型成纤维细胞型上皮型细胞游走细胞型多形型细胞（二）悬浮型（三）半贴壁型（一）贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞贴附:是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式结果:基于贴附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须贴附于一固相表面才能生存和生长。培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要贴附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于贴附型细胞贴附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有贴附于固相表面才能生存的细胞名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞：心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2—3个长短不等的突起，中有卵圆形核生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片，细胞—细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起1、成纤维细胞型：名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同来源：来源于外胚层、内胚层细胞,如：皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形，中有圆形核生长特点：易相连成片，相靠—紧密相连—成薄层—铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动2、上皮型细胞：3、游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。4、多型细胞型：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。来源：自血，脾或骨髓，血中白细胞癌肿细胞特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团（二）悬浮型：细胞传代细胞传代方法介绍根据细胞生长的特点，传代方法有3种：1．悬浮生长细胞传代(HL-60)离心法传代：离心（1000rpm）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。2．半悬浮生长细胞传代（GH3细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3．贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。贴壁细胞传代PBS/生理盐水wash，胰酶消化加入完全培养基，计数，离心重悬，分到相应的培养皿细胞计数染料：0.4%trypanblue鉴定细胞死活。原理：活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。准备：取10ul细胞悬液与10ultrypanblue混合均匀，上样细胞转染方法电击法磷酸钙法脂质体介导法病毒介导法脂质体转染原理：阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用，将DNA分子包裹入内，形成DNA-脂复合物，也能被表面带负电的细胞膜吸附。再通过融合或细胞内吞进入细胞。实验数据病毒包装系统病毒表达系统腺病毒表达系统慢病毒表达系统病毒基因组双链DNA病毒RNA逆转录病毒自主复制不能不能是否整合病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时表达外源基因病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达外源基因感染细胞类型感染绝大多数细胞，包括分裂期、非分裂期细胞感染绝大多数细胞，包括分裂期、非分裂期细胞表达丰度高水平表达中水平表达滴度滴度可达10E12pfu/mL滴度可达10E9－10E10TU/mL克隆容量滴度随插入片段长度增加而降低可插入不超过8kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低是否可以自行扩增可以需要特殊包装系统和包装环境细胞的冻存与复苏原则：慢冻速融慢冻是为了防止降温过快，导致细胞内外水迅速结晶化，从而导致细胞结构破坏蛋白质变性ph改变等不良后果，对细胞造成损害。慢冻还能使细胞缓慢失水，减少胞内结晶的形成从而保护细胞。快融是防止在融化过程中已融解水渗透入细胞导致的二次结晶对细胞形成损害。冻存预先配制冻存液：含20%血清培养基，10%DMSO，DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1×106-5×106细胞/mL)。加入1mL细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。复苏从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分钟左右）加入约10倍体积的完全培养基，离心，去上清重悬，分到细胞培养板里细胞状态监测流式细胞术检测细胞周期、凋亡单参数分析——PI染色法以荧光探针PI（碘化丙锭）特异性染料标记细胞的DNA，通过观察这些成分的含量变化来区分细胞周期。PI是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。流式细胞仪分析常用的流式细胞术分析细胞周期的方法是依据细胞DNA含量（横坐标）来分析的：G1期：DNA复制还没开始，也是DNA含量最少的，即流式检测结果图的第一个峰；S期：DNA开始复制，到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA的过程，在流式结果图中显示期跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）；G2期：DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA，在流式结果图中的第三个峰；M期：细胞分裂过程，此时细胞内也是二倍DNA，用DNA含量的方法是无法与G2期分开，所以有第三峰明显升高时报告：G2/M期阻滞。双参数分析：应用两种荧光染料标记细胞的成分。例：AnnexinV-PI的双染色法。AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）高亲和力特异性结合。以标记了FITC的AnnexinⅤ作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。将AnnexinⅤ与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。流式细胞仪分析AnnexinV/PI的双染色法左下象限显示正常活细胞，为ITC-/PI-；右上象限为晚期凋亡细胞或者坏死细胞，为FITC+/PI+；右下象限为早期凋亡细胞，呈现FITC+/PI-早期凋亡细胞活细胞晚期凋亡，坏死细胞优点：对早期凋亡细胞检测灵敏细胞不需固定，省时省力结果更可靠MTT检测MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。MTT法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。