药物分析第九章

第九章体内药物分析简介药物分析的重要分支学科研究生物机体中外源性药物及其代谢物和内源性活性物质的质与量的变化规律药物的体内研究和治疗药物监测综合性较强的应用学科——分析方法学体内药物分析是指通过分析手段了解药物在体内的数量和质量的变化，获得药物动力学的各种参数，以及药物在体内转变、代谢的方式、途径等信息。从而为药物生产、医疗临床、实验研究等方面对所研究的药物作出估计与评价，以及对药物改进和发展作出贡献。一、体内药物分析的性质及意义体内药物分析是一门研究生物机体中药物及其代谢物和内源性物质的质与量变化规律的分析方法学它是药物分析的重要分支，又是现代药学的发展。体内药物分析直接关系到药物研制，临床试验、使用，药物作用机理探讨，药物质量评价等各阶段的工作。体内药物分析又被称为“生物医药分析”（BiomedicalAnalysis）“生物药物分析”（BiopharmaceuticalAnalysis）体内药物分析的重要性药物质量及质量控制经典——药物的鉴别、检查、含量测定等理化指标现代——药物存在“化学上等价而生物学上不等价”现象——进行临床药学研究——并逐步建立和发展了生物药剂学（Biopharmacy）和临床药理学（Clinicalpharmacology）等在临床药学研究过程中——涉及药物在体内各个过程中的数量和质量的变化——形成了药物分析的新学科——体内药物分析——为临床药学研究提供必要的数据和相关信息二、体内药物分析的对象和任务人体机体：人和动物具体检材：生物体的各种器官、组织、体液（血液、尿液、唾液）及呼出气体中与药物有关的成分等。评价药物的安全性（临床前研究）——动物评价药物的有效性（临床研究）——人体（健康志愿者或患者）用药的安全、有效与合理——人体（患者TDM:治疗药物血浓度监测）①进行体液和组织中药物及其代谢物的测定——临床药物监测、药物动力学等数据、信息。②进行新测定方法的研究、开发，为常规测定提供灵敏、专属、可靠的分析方法。③进行方法学研究，提供合理的、最佳的分析条件；探讨各种方法用于体内药物分析中的规律性问题。④提高和增进测定技术及效率，进行分析质量管理工作，以获得可靠的结果。⑤参与临床和药理研究中所获得结果进行阐明工作。研究任务:三、体内药物分析的特点——由分析对象的特点所决定：1．干扰物质多——生物样品中含有大量的内源性物，如质蛋白质、脂肪等，以及代谢物、结合物等干扰分析——样品一般均需经过分离、净化后才能进行分析2．样品量少、不能重复取样——生物样品多数在特定条件下采集，无法再次取样，且浓度低、变化幅度大——在测定前需浓缩、富集以适应分析方法要求3．被测成分浓度低——对分析方法的灵敏度及专属性要求较高4．药物浓度监测和药物滥用——要求分析方法简便、快速被测定的药物和代谢物的浓度或活性极低；样品复杂，干扰物多，大多需要分离和净化；样品量少，不易重新获得；在毒物学检测中要求能很快地提供结果；分析方法具有类型多样化和综合性。分析方法的新要求药物服用的剂量越来越小、体液中药物浓度越来越低，对体内药物分析方法提出了新的要求：1.检测方法的高灵敏度——最低检测量10-9-10-7g或10-15-10-12g2.分离方法的高选择性、高专属性。为满足各项要求，最常用的分析方法有①光谱法——比色法、紫外分光光度法、荧光分光法、原子吸收分光光度法②色谱法——TLC、GC、HPLC（柱切换、手性药物）、HPCE（high-performancecapillaryelectrophoresis高效毛细管电泳法）③免疫分析法——RIA放射免疫法、EIA酶免疫法、化学发光酶免疫、荧光免疫分析④联用技术——GC-MS、LC-MS四、体内药物分析的发展概况及趋势20世纪60年代——临床药理学与生物药剂学的建立70年代初——体内药物分析在国外开始建立70年代末——血药浓度监测广泛用于临床80年代——体内药物分析学科雏形基本形成国内发展概况：在70年代末受到关注1979年有相关论文的发表1981年在“中国药学会药物分析第一次学术会议”大会上作学术报告，引起了广泛的关注和兴趣80年代中期，许多高等医药院校为本科生、硕士研究生开设了体内药物分析必修和选修课程仪器化自动化微机化网络化第二节样品的种类、采集与贮存样品的种类：血液（血浆、血清、全血）、尿液、唾液样品的采集：①根据不同的分析目的和要求进行选取；②所取样品应能正确反应药物的浓度与效应之间的关系；③样品易于获取，便于处理、分析。样品的贮存和稳定性一、样品的采集血液(血浆、血清)—体现药物浓度和治疗作用之间的关系——最常用的生物样本生物样品脏器组织体液血液、尿液、唾液、毛发、乳汁、精液、脑脊液、泪液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便等（一）血样因血液中药物浓度可以较好地体现药物浓度和治疗作用之间的关系，是最为常用的生物样品----分为全血、血浆和血清1.血样的采集一般用注射器直接采集静脉血，每次1～3ml；动物实验时，采血量不宜超过动物总血量的十分之一。药物在血液中分布均匀后取样。2.血样的制备测定血中药物的浓度，通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，尤其是血浆，并非指全血。通常由采取的血样制备血浆和血清。血浆的制备：采集的静脉血液置含有抗凝剂的试管中，混合后，以2500～3000r/min离心5～10min使与血球分离，所得淡黄色上清液即为血浆。抗凝剂—最常用的是肝素，其它抗凝剂EDTA、枸橼酸盐、草酸盐等血清的制备采集的静脉血液置试管中，于37℃或室温放置30min～1h。血液凝固后，用细竹棒或玻璃棒轻轻剥去试管壁上的血饼，再在2500～3000r/min离心5～10min，上层淡黄色液体即为血清血浆与血清的区别血清比血浆只是少一种纤维蛋白原血浆比血清的分离快，而且制取量约为全血的50%～60%（血清为全血的20%～40%），多数用血浆进行分析。若血浆中含有的抗凝剂对药物浓度测定有影响时，则应使用血清样品。全血的制备成分血浆有形物质红细胞白细胞血小板全血的制备某些情况血浆内药物浓度波动大，或血浆浓度低，可用全血（全血净化较血浆和血清麻烦）；血浆和红细胞中分配比不是常数，则应使用全血样品例：三环类降压药在个别病人体内血浆和红血球中的分配比不是一个常数，故宜采用全血样品进行药物动力学的研究将采集的血液置含有抗凝剂的试管中，但不经离心操作，保持血浆和血细胞均相状态，即为“全血”（二）尿液尿液用于药物剂量回收、肾清除率、生物利用度的研究，预测药物代谢过程、类型体内药物清除主要是通过尿液排出，药物以原型、Ⅰ相及Ⅱ相代谢物等多种形式排出性状—淡黄色或黄褐色，相对密度1.105～1.020，pH4.8～8.0成分—水、含氮化合物、盐类等微生物—防腐剂尿液的采集样本来源—自然排尿，成人一日排尿量为1～5L（随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿）样本采集—一般采集时间尿（规定时间内）采集尿液体积和排入尿中的药物总量（三）唾液唾液—无损伤取样，易收集；一些药物的唾液药浓(S)与血浆游离药浓(P)密切相关，因此：TDM中利用对S的测定代替对P的监测在潄口后15min，安静状态下采集口腔内自然流出的唾液；也可在刺激下快速采样(需注意干扰)物理法：口嚼石腊片、聚四氟乙烯块或纱布球等化学法：将柠檬酸或维生素C等置于舌尖，弃去初始部分后采集化学法的优点：缩短采样时间减小唾液pH波动（pH≈7.0），S/P个体差异小唾液样品的制备唾液样品采集后，应立即测量其除去泡沫部分的体积，以3000r离心10min，取上清液直接测定或冷冻保存样品的贮存和稳定性（一）贮存冷藏—冰箱(4℃)中短期保存冷冻—冷柜(-20℃)或低温冷柜(-80℃)中长期保存冷藏或冷冻时限经稳定性考察后确定血样采集后及时分离血浆和血清（≤2h），分离后再贮存—若不予先分离，血凝后冰冻保存，则因冰冻有时易引起细胞溶解，会阻碍血浆或血清的分离—置硬质玻璃试管中完全密塞后保存尿样采集后应立即测定，若不能立即测定，加入防腐剂后保存常用防腐剂：甲苯、二甲苯、氯仿、醋酸、浓盐酸等甲苯在尿液表面形成薄膜醋酸改变尿液酸碱性抑制细菌的生长保存时间为24～36h(4℃)或长期(-20℃)唾液为阻止酶催化生成粘蛋白，应在4℃以下保存—保存过程中放出二氧化碳而使pH升高，测定唾液pH时应在取样的当时为好—冷冻保存唾液时，解冻后有必要将容器内唾液充分搅匀后再用，否则测定结果会产生误差第三节样品的预处理与制备（一）样品预处理技术分离、纯化、富集或化学衍生化等，为药物的最终测定创造良好的条件样品的预处理是体内药物分析中极为重要的环节；也是分析中最困难、最繁杂的工作——对于生物样品的预处理很难规定固定的程序和方式，必须结合测定实际和要求，采取恰当的方法和技术生物样品预处理的目的1.使药物从缀合物及结合物中释放——测定药物的总浓度2.使样品纯化——消除生物基质中内源性物质的干扰3.提高检测灵敏度——适应和符合测定方法要求的灵敏度4.防止分析仪器的污染和劣化——提高分析仪器的耐受程度、改善分析结果（二）样品纯化生物样品的基质——组成复杂、干扰多血清中含有高分子的蛋白质和低分子的糖、脂肪、尿素等有机物，也含有Na+、K+、Cl-等无机物尿液中含有尿素、肌酸、尿囊素、氨、Na+、K+、Cl-等药物组分——药物含量低，一般为g或ng水平，经预处理使纯化、富集二、样品制备时应考虑的问题1.被测组分的理化性质、存在形式、浓度范围2．测定目的3．生物样品种类和基质的干扰类型4．样品的化学组成5．药物的蛋白结合率6．被测组分在预处理过程中的稳定性7．样品在收集、储存和预处理中容器的污染8．保证必要的专属性、灵敏度、精密度和准确度的前提下预处理过程尽量简单三、样品的预处理与制备技术样品的预处理大致分为以下五类1．有机破坏法2．去除蛋白法3．溶剂萃取法4．缀合物的水解5．化学衍生化法（一）有机破坏法应用——微量元素测定方法1．湿法破坏2．干法破坏3．氧瓶燃烧法返回毛发样品的制备三、预处理与制备1.湿法破坏常用试剂—硝酸或硝酸-高氯酸特点—破坏能力强、反应激烈，无机金属离子为高价态应用—适用于血、尿、组织等生物样品的破坏缺点—含氮杂环药物的破坏不够完全注意—切勿蒸干、以免爆炸样品用量—金属元素量10~100g，血样10~15ml、尿样50ml2.干法破坏高温炉高温破坏应用——适合人发样品的破坏3.氧瓶燃烧特点：操作简单、快速、设备简单应用：血浆、人发中卤素、硫、硒等血浆：血浆1ml分次点于无灰滤纸上→60℃烘干→按规定折叠后固定人发：洗净、干燥（60℃～80℃）→剪碎→称取0.1～0.3g置无灰滤纸中心→按规定折叠固定（二）去除蛋白质非破坏性生物样品预处理的第一步，可使结合型药物释放1.去除蛋白后取上清液直接分析测定2.去除蛋白后取上清液经进一步分离、纯化、浓集后分析测定去除蛋白质的方法1.加入与水混溶的有机溶剂—蛋白质，脱水沉淀2.加入中性盐—“盐析”沉淀蛋白质3.加入强酸—与蛋白质阳离子(铵基)形成不溶性盐沉淀4.加入重金属盐—与蛋白质阴离子(羧基)形成不溶性盐沉淀5.超滤法—半透膜滤除可溶性生物大分子物质(蛋白质)6.酶水解法—蛋白分解酶分解蛋白质7.加热法—蛋白质变性凝固加入与水相混溶的有机溶剂1.常用有机溶剂:乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃血样与溶剂体积比—1∶(1～3)可除去90%以上蛋白质乙腈—块状絮凝物、易于分离；成分损失可能性大，上清液pH为8.5~9.5甲醇—细小颗粒沉淀、不易分离；成分损失可能性小，上清液pH为8.5~9.5超速离心分离（12000r/min)—离心1~2min2.加入中性盐常用中性盐—饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等试剂用量—血清与饱和硫酸铵比例为1∶2时除去90%以上的蛋白质分离—高速(12000r/min)离心上清液—pH7.0～7.73.加入强酸常用的强酸——10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏磷酸等试剂用量——血清与强酸比例为1∶0.6时，除去90%以上的蛋白质分离——高速(12000r/min)离心1～2m