园艺植物生物技术第三章

HorticulturalPlantVirus-FreeandRapidpropagationinvitro园艺植物脱毒与离体快速繁殖Contents1.HorticulturalPlantVirus-Free脱毒的意义脱毒的方法脱毒植物的鉴定2.Rapidpropagationinvitro离体快繁意义方法3.Artificialseed人工种子1.1Damageofvirus全世界已发现植物病毒有近788种。1.组织和细胞病变；2.新陈代谢等生理机能受到干扰；3.外观表现不正常状态；4.病毒经无性繁殖逐代积累，导致种性退化，造成产量下降或品质降低甚至全株死亡，给农业生产造成巨大损失。Part1HorticulturalPlantVirus-Free1.SignificanceofPlantVirus-Free1.2.Concept：采用一定的方法除去植物体内病毒的技术。Virus-freeseedling无病毒苗：指不含该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物体内的存在表现阴性反应的苗木。1.3SignificanceofPlantVirus-Free任何一种优良品种均需有一个稳定地保存其遗传性状的繁殖方法。离体无性繁殖可以很好地保持品种的优良特性，是无性繁殖品种繁育的理想途径。1.3.1.能够有效地保持优良品种的特性1.3.2.快速繁殖品种，使优良品种迅速应用◆离体繁殖周期短◆不受季节限制◆繁殖系数高◆繁殖速度是任何其他方法所不能比的，又称之为快繁1.3.3.生产无病毒种苗，防止品种退化受病毒危害严重的作物：大田作物：马铃薯、甘薯、甘蔗、烟草蔬菜：白菜、大蒜、葱、番茄、箩卜果树：柑橘、苹果、草莓、香蕉花卉：香石竹、各种菊花、天竺葵、紫罗兰1.3.4.节约耕地，提高农产品的商品率块根、块茎、鳞茎为繁殖器官的作物，每年产品用留作种的比例：◆大蒜：留种量占产量的五到八分之一◆马铃薯：留种量占产量的十分之一◆贝母：留种量占产量的三分之一1.3.5.便于运输常规的块根、块茎等，体细胞大、含水量高，包装、运输十分不便。离体繁殖的种苗体积小，易携带，运输十分方便。以马铃薯为例：按一亩地4000株计算，常规薯4000个重200kg（每个50g），若用试管薯4000个则只有2kg（每个0.5g）。脱毒与未脱毒马铃薯对比2.Principalandmethods2.1Principala.植物病毒本身不具有主动转移的能力在一个植物体内，病毒易于通过维管系统而移动，但在分生组织中不存在维管系统。病毒在细胞间移动只能通过胞间连丝，速度很慢，难赶上活跃生长的茎尖；b.在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性高，竞争抑制了病毒的复制；c.在植物体内，可能存在着病毒钝化系统，它在分生组织中比其他任何区域具有更高的活性。d.在茎尖存在高水平内源生长素，也可能抑制病毒的增殖。2.2methods物理方法化学方法生物方法高温处理茎尖培养微体嫁接珠心培养愈伤脱毒热处理脱毒热处理脱毒原理病毒DNA分子进入细胞后随植物细胞DNA一起复制。热处理并不能杀死病毒，只能钝化病毒活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，失去传染能力。作为一种物理效应可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。2.2.1Heattreatment热处理脱毒法热处理方法（1）愈伤组织热处理离体培养愈伤组织热处理继代分化培养。常用温度及时间：低温37—38℃处理2周、4周或8周；高温50℃处理3—5min。（2）热空气处理脱毒法试验母株在高温生长室中生长一段时间，其顶端分生组织比次生分生组织生长迅速，后切取其茎尖分生组织进行离体培养。生长室温度35-40℃光照3000—10000lxAdvantages:方法简单，效果明显。disadvantages:1)具有局限性，不能去除所有病毒。只对圆形病毒（苹果花叶病毒），或对线状病毒（马铃薯卷叶病毒）有效；而对杆状病毒（千日红病毒）无效。2)热处理后只有小部分植株能够存活。极易使植物材料受热枯死，造成损失3）延长热处理时间，病毒钝化效果好，同时也可能会钝化植物组织中的抗性因子而降低处理效果。Advantagesanddisadvantages其它效果•香石竹（康乃馨）在38℃～40℃下经两个月处理可除去全部病毒。马铃薯在37℃下处理10～20天能除去卷叶病毒。2.2.2Virus-freebytissueculture组织培养脱毒法包括茎尖培养脱毒、愈伤组织培养脱毒、珠心组织培养脱毒。（1）meristemculture茎尖培养脱毒法脱毒效果好后代遗传稳定使用最广泛的一种方法1）原理及依据病毒在植物体内分布不均，茎尖处含量最少病毒DNA分子与细胞分裂蛋白质合成竞争2）操作程序外植体经表面消毒灭菌后，在解剖镜下，经无菌操作切取小茎尖，接种到备用培养基上，放入培养室内进行培养，并及时观察和记录培养结果。茎尖培养①茎尖大小：一般以带1-2片叶原基为好，大小为0.2-0.3毫米为宜，超过0.5毫米时，脱毒效果差。（外植体过小茎尖存活率低）②培养基：能使茎尖快速生长、分化的培养基均适于脱毒。③前处理：切取茎尖之前，植物材料如经过预处理，如热水或热空气处理、低温处理、药物处理，均可大大提高脱毒效率。④培养条件：同一般茎尖培养⑤外植体生理状态：由活跃生长的芽上切取优缺点：茎尖越小，去病毒机会越大，脱毒效果就越好，但同时因为其含营养及水量太低，故培养时对培养基的要求就越高，对剥离技术要求也越高。（2）Callusculture愈伤组织培养脱毒法1）原理及依据①病毒在植物体内分布不均匀②病毒复制的能力衰退或丢失③继代培养的愈伤组织产生抗性变异2）技术关键诱导再生植株的愈伤组织3）操作程序植物各种器官或组织诱导产生出愈伤组织，愈伤组织多次继代，然后从愈伤组织再诱导分化芽，长成植株。愈伤组织培养脱毒法脱毒效果不定，常出现一些变异。（3）Nucellartissueculture珠心组织培养脱毒法病毒是通过维管组织传播，而珠心组织和维管束系统无直接联系，故可以通过珠心组织离体培养获得无病毒植株。目前已用该方法去除了柑橘银屑病、叶脉突出病、柑橘裂皮病、速衰病等病毒。缺点：会有20%~30%左右的变异率，同时无毒苗苗期较长。柑橘要6~8年才能结果。2.2.3.micro-graftinginvitro应用微体嫁接的原因：木本植物茎尖培养难以生根形成植株。具体做法：将极小的茎尖（0.14mm~1.0mm）作为接穗嫁接到不带病毒的种子实生苗砧木上，然后将砧木、接穗一起在培养基上培养。优点：接穗在砧木上易成活，故可用很小的茎尖来培养，去除病毒几率大，获得无病毒苗的可能性大。微嫁接要求的剥离技术高，嫁接成活率与接穗大小呈正相关，而脱毒率与接穗大小呈负相关。微体嫁接法(micro-grafting)脱除病毒的关键：①要求剥离技术很高②需要考虑砧木和接穗对营养组成的不同要求；③与接穗的取材季节有密切关系（苹果4~6月取材嫁接成活率较高。）3.1.Morphologyidentification形态检测法看植株的茎叶是否有该病毒所有可见症状。番茄无菌小苗厚叶莲花掌3、Virus-freeseedlingidentification植物病毒的症状植物病毒引起植株的症状是各异的，在观赏植物上由病毒引起外部症状主要有以下几种：①变色：褪绿、黄化、花叶、斑驳、红叶等，常见病毒有；香石竹斑驳病毒、黄瓜花叶病毒、芋花叶病毒等。②坏死：常见的坏死是病斑或斑点。有轮斑、环斑、条斑等。如香石竹坏死斑点病毒、，凤仙花坏死斑点病毒草等。③畸形：植株可出现矮缩、矮化或叶片皱缩、卷叶、蕨叶等病状。④萎蔫：主要是指植物根或茎的维管束组织受到破坏而发生供水不足所出现的凋萎现象。3.2.indicatingPlant指示植物法指示植物接穗嫁接后的植物定义:将一些对病毒敏感、症状特征显著的植物作为指示植物(又叫鉴别寄主),利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的方法.Advantages:方法简单、灵敏、准确、方便Disadvantages:枯斑法不能测出病毒总的核蛋白浓度,而只能测出相对的感染力Advantagesanddisadvantages3.3.Electronmicroscopeidentification电子显微镜鉴定法小于0.1mm的病毒颗粒用电子显微镜直接观察经脱毒培养的叶片，检查是否有的病毒粒子存在，还可测量病毒颗粒的大小、形状和结构。较为先进的方法，但需一定的设备和技术利用抗原与抗体特异反应的特性，用已知病毒的抗血清来鉴定未知病毒的种类，常用的有沉淀反应法、琼脂扩散法、酶联免疫吸附法。其中酶联免役吸附反应（ELISA）是常用的一种方法。抗血清的基本原理是通过植物病毒的抗原与抗体的专化结合,形成可见反应而加以判断。由于植物病毒抗血清具有高度的专化性,受体植物无论显、隐症,无论是何种传播介质,均可通过抗血清反应法准确判断病毒的存在与否,进行病毒的快速诊断。3.4.Antiserumidentification抗血清鉴定法3.5.Moleculartechniquesidentification分子生物学鉴定（1）核酸杂交技术（2）PCR法（3）dsRNA分析（4）电镜检测法4、Thepreservationandpropagationofvirus-freeseedling4.1Thepreservationofvirus-freeseedling(1).隔离保存专用的隔虫纱网棚室离体培养2.低温保存将无病毒苗原种的器官或幼小植株接种到培养基上，低温下离体保存，是长期保存无病毒苗及其他优良种质的方法。只需半年或一年更换培养基，也叫最小生长法。3.冷冻保存（超低温保存）用液氮（-196℃）保存植物材料的方法。常用冷冻保护剂为DMSO（5-8%）、甘油、脯氨酸（10%）、各种可溶性糖、聚乙二醇等。4.2Thepropagationofvirus-freeseedling1、继代培养快速繁殖：愈伤、不定芽、丛生芽2、快繁苗的生根及微型鳞芽的培养Part2Rapidpropagationinvitro1.Introduction1.1Concept指通过无菌操作，将外植体接种于培养基上，在人工控制的营养和环境下进行培养，使其在较短时间内快速地再生出遗传性一致的大量完整植株的方法，是工厂化育苗的技术基础。1.2Advantagesofrapidpropagationinvitro1).繁殖效率高，生长速度快；2).培养条件可控制性强，可周年生产（一般6个增殖周期/年）；3).占用空间小；4).管理方便，利于自动化控制；5).便于种质交换和保存。1.繁殖稀缺或急需的良种植物；2.无病毒苗木的快速繁殖，如草莓、马铃薯、香蕉等；3.自然界无法用种子生产繁殖或难以保持后代的三倍体、单倍体及基因工程植株的快速繁殖；4.拯救濒危植物；5.种质的保存和交换。1.3Application2.Methods2.1Theestablishmentofthesterileculturesystem1).母株和外植体的选取：母株性状稳定、健壮、无病虫害。木本与较大草本----茎段、顶芽、腋芽；草本----叶片、叶柄、花茎、花瓣2).无菌培养物的获得：15d3).外植体的启动生长：腋芽----细胞分裂素0.5~1.0mg/L，生长素0.01~0.1mg/L；不定芽----较高水平细胞分裂素；愈伤----生长素多。需要4-6周。2.2Shootproliferationapproach茎芽增殖的途径侧芽增殖途径（lateralbudproliferation）不定芽增殖途径（adventitousbudproliferation）体细胞胚增殖途径（somaticembryoproliferation）原球茎增殖途径（protocorm-likebodyproliferation）4-8周继代一次。一个芽苗增殖数量一般为5-25个或更多，多次继代可大量繁殖。增殖培养基适当提高细胞分