园艺植物生物技术第二章 园艺植物脱毒

第二章园艺植物脱毒与离体快速繁殖第一节园艺植物病毒病的危害多数无性繁殖的园艺植物易受到病毒的侵染，病毒侵染可经带毒的无性繁殖材料传至下一代，并逐渐积累，导致植物种性退化，造成作物产量下降或品质降低甚至死亡。由病毒引起的植物病害称为植物病毒病(Plantvirusdisease)一、植物病毒的概念与形态早在17世纪初，郁金香等植物表现花叶、黄化、矮缩等症状，当时人们把这些异常现象，都归诸于生理的或遗传的原因，或其他毒素的作用。1886年，德国人Mayer发现，把烟草花叶病植株的汁液,接种到无病烟草上，可以使健康植株发病，于是他断定烟草花叶病是由细菌引起的。1892年，伊万诺夫斯基（俄国）发现，烟草花叶病的病原物可以通过细菌不能通过的微孔漏斗，因此他认为烟草花叶病的病原不是细菌，而是一种“传染性活液”。1898年，荷兰人Beijerind把这种“传染性活液”定名为病毒（virus)。其后又经过近40年，美国的Stonley(1935)把烟草花叶病毒提纯，得到它的结晶体，证实病毒是一种含有核酸的蛋白质，并逐步明确病毒是由一种核酸和蛋白质衣壳组成，非细胞形态的分子生物。病毒是一种非细胞形态的专性寄生物，仅含有一种核酸(RNA或DNA）和蛋白质，必须在活细胞中才能增殖。病毒粒体有杆状、线状、球状3种。不同形态的病毒其大小也不同，计量单位用纳米（nm）表示。病毒是介于生命与非生命之间的一种物质形式，因此我们说它是边缘生命。病毒存在于环境之中，游离于细胞之外时，不能复制，只以一种有机物的物质形式存在。但病毒进入细胞之后，它可以控制细胞，使其听从病毒生命活动需要，表现它的生命形式。因此，病毒是由一个或几个核酸分子组成的基因组，有一层蛋白或脂蛋白保护性外壳，且可在一定宿主细胞中自我复制的感染性因子。病毒的生命形式极其经济，因为基因组中的每个核苷酸均有用。病毒最明显的特点是病毒极其自私，复制原料和能量全部来自它所寄生的细胞，并使细胞产生病变。在进化过程中，它会与细胞和平共处，便于更好利用细胞的资源，但是病毒引起的病害常常是突发性的。如人类的肿瘤，往往是多年潜伏，一旦条件适合或受到外界刺激利于病毒的增殖，病毒就会突然致病。然而病毒可以被改造和利用，如基因治疗的在基因工程中用做载体。HIVSARS二、园艺植物病毒病的危害特点园艺植物的特点：种类和繁殖方式多样性蔬菜：一年生为主，种子、块茎、鳞茎；寄主复杂，媒体传播、种子传播果树：一旦感染终生带毒；无性繁殖系数决定了病毒传播速度；病毒侵染破坏正常代谢，导致树体衰退；表现：削弱生长势，降低产量、品质、价值，严重者导致死亡。园艺植物病毒病的严重性据不完全统计，草莓能感染62种病毒和类菌质体。核果类病毒达90多种。马铃薯病毒达30余种，苹果也有30多种病毒侵染，柑桔有20多种病毒，观赏植物的病毒病达100多种。症状表现:在田间，病株较健株生长矮小且衰弱，叶色淡。病株嫁接口周围肿大。木质部表面产生深褐色凹陷裂沟。症状表现:病叶片上产生淡绿色或浅黄色环斑，发生无规律，有时病斑只发生在主脉或侧脉的周围。高度感病品种的病叶往往变形或卷曲。病斑偶尔也发生在果实上，但病果不变形果肉组织也无明显损伤。有些品种无明显症状，或仅有淡绿色或黄绿色小斑点组成的轻微斑纹。阳光充足的夏季症状明显，而且感病品种的叶片上常出现坏死区域。多雨季节或阳光不充足时，症状轻微。带毒梨树的干周生长量减少10%，新稍生长量和叶面积减少20%，树势衰弱且易遭冻害。水稻矮小病毒花生矮缩病毒枣树病毒病：示病树干部皮层扭曲示皮层内的黑褐色“木刺”番茄条斑型病毒病病果大白菜病毒病又叫孤丁病、抽疯病，苗期发病心叶呈明脉或叶脉失绿，后产生浓淡不均的绿色斑驳或花叶。成株期发病早的，叶片严重皱缩，质硬而脆，常生许多褐色小斑点，叶背主脉上生褐色稍凹陷坏死条状斑，植株明显矮化畸形，不结球或结球松散。甜菜黄化病毒大葱萎缩病毒三、园艺植物病毒病的传播途径及防治传播途径：介体传播：昆虫，线虫，螨虫接触传播：汁液，人为，嫁接防治：栽培无病毒苗木；加强检疫；防治传毒虫媒；抗病毒基因工程。四、园艺植物脱毒技术脱毒的意义应用植物脱毒技术培育无病毒苗可以使品种复壮，增强适应能力和抗逆能力，明显提高作物的产量和品质。脱毒方法1.茎尖培养脱毒2.微体嫁接脱毒3.热处理脱毒4.热处理结合茎尖培养脱毒5.抗病毒药剂脱毒1.茎尖培养脱毒又称为分生组织培养（meristemculture）1934年，White发现TMV在烟草根中的分布是不均匀的，越靠根尖区病毒含量越低，在根尖的顶端不含病毒。1949年，Limasset和Cornuet茎尖分生组织叶不带病毒。1952年，Morel和Martin首先利用茎尖分生组织培养获得了大丽花和马铃薯无病毒苗，同时建立了茎尖脱毒的组织培养技术体系。2001年，Ayabe和Sumi报道利用大蒜茎片生长点培养脱除病毒的方法。病毒在植物体内分布不均匀的机理目前还不十分清楚，但根据病毒及分生组织的特性，学者们提出了一些假说，主要有以下几种：能量竞争病毒核酸和植物细胞分裂时，DNA合成均需要消耗大量的能量。传导抑制1966年Quak：病毒传播主要是通过微管束，但分生组织中胞间连丝和微管组织还不健全。激素抑制1977年，Quak：分生组织中高浓度的生长素和细胞分裂素阻滞了病毒的侵入或抑制了病毒活性。酶缺乏1969年Stace－Smith认为病毒合成可能需要酶的参与。抑制因子1976年Martin－Tanguy认为分生组织中自然存在某种抑制因子。茎尖脱毒培养繁育程序通常茎尖培养脱毒效果的好坏与茎尖大小呈负相关，而培养茎尖成活率的高低则与茎尖的大小呈正相关。一般切取0.2~0.5mm，带一两个叶原基的茎尖作为培养材料较好。2.微体嫁接脱毒（micrograftingofshoottip）微体嫁接是组织培养与嫁接方法相结合来获得无病毒苗木的一种新技术。它是将极小（0.1~0.2mm)的茎尖作为接穗，嫁接到由试管中培养出来的无菌实生砧木上，继续进行试管培养，愈合成为完整的植株而达到脱毒的效果。2.微体嫁接脱毒（micrograftingofshoottip）影响微体嫁接成活的因素主要是接穗的大小和取样时间。一般春天从新梢上取材嫁接的成活率显著高于其他季节取材的成活率。微体嫁接技术难度较大，不易掌握，与实际应用还有相当距离。但随着新技术的发展与完善，微体嫁接技术也会有很大发展。3、热处理脱毒发现：1889年，印度尼西亚爪哇将患枯萎病的甘蔗放在50~52℃热水中30min，甘蔗就可去病生长良好通过热处理（heattreatment），又称温热疗法（thermotherapy），可由受侵染的个体得到无病毒植株。利用植物和病毒的耐热性不同，在高于正常温度的环境条件下，植物组织中的很多病毒受热后可被部分或全部钝化或失去活性，而寄主植物组织很少或不会受到伤害；或在高温条件下，植物的生长加快，病毒的增殖速度跟不上植物的生长速度而被抛在其后，使植物的新生部分不带病毒。热处理的方法热水浸泡：是将剪下的接穗或种植材料，在50~55℃的热水中浸泡数分钟或35℃温水处理30-40h,方法简便，但易使材料受损伤，到55℃时则大多数植物会被杀死。该方法适合甘蔗、木本植物和休眠芽。高温空气是将旺盛生长的植物在35~40℃条件下生长发育，处理时间的长短，因病毒种类不同可由数分钟到数周不等，热处理之后要立即把茎尖切下来嫁接到无病的砧木上或进行组培。该方法对活跃生长的茎尖效果较好，既能消除病毒，又能使寄生植物有较高的存活机会，目前热处理大多采用这种方法。缺陷：热处理只对那些球状的病毒(如葡萄扇叶病毒、苹果花叶病毒)或线状的病毒(如马转薯X，Y病毒、康乃馨病毒)有效果，而对杆状病毒(如牛蒡斑驳病毒、千日红病毒)不起作用。香石竹在38－40℃条件下经两个月处理可除去全部病毒。菊花在35℃－38℃的条件下处理60d可使病毒失活。马铃薯在37℃条件下处理10－20d能除去卷叶病毒。柑橘黄化病毒30℃－40℃条件下处理7－12周。4.热处理结合茎尖培养或微嫁接技术脱毒将热处理与茎尖分生组织培养结合起来，则可以取稍大的茎尖进行培养，这样能够大大提高茎尖的成活率和脱毒率。5.抗病毒药剂脱毒在茎尖培养和原生质体培养中，在培养基内加用抗病毒醚(ribavirin)，能抑制病毒复制。山家弘士(1986)发现抗病毒醚对苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)和苹果茎沟病毒(ASGV)，在苹果植株体内都有抑制增殖效果。目前用此法也不可能脱除所有病毒，如果使用不当，药害现象比较严重，此种脱毒处理还处于探索阶段。五脱毒苗的鉴定及检测技术脱毒效果的检测1、形态检测法脱毒苗叶色浓绿，均匀一致，长势好2、指示植物法指示植物法是利用病毒在其他植物上产生的枯斑和某些病理症状，作为鉴别病毒及病毒种类的标准，也叫枯斑或空斑测定法。接种某种病毒后能快速表现特有症状的植物称为指示植物（indicatorplant），又称鉴别寄主。2、接种方法汁液摩擦接种法嫁接法：小叶嫁接法双重芽嫁接法双重切接法指示植物直接嫁接法汁液摩擦接种法：从被鉴定植物上取1~3g幼叶→研碎→过滤→取滤液涂抹于指示植物的叶面上（金刚砂）→保温15~25℃→接种后2~6d可见症状出现。血清学鉴定植物病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋白(抗原antigen)，给动物注射后会产生一种相应的免疫球蛋白，称为抗体（antibody）抗体是动物在外来抗原的剌激下产生的一种免疫球蛋白，抗体主要存在于血清中，故含有抗体的血清即称为抗血清(antiserum)。这种抗原和抗体所引起的凝集或沉淀反应就叫做血清反应。因此，利用已知的抗体与未知的抗原能否特异结合形成抗原-抗体复合物（血清学反应）的情况可以判断病毒的有无。常用血清学鉴定方法（1）免疫电镜技术（2）酶联免疫吸附分析（3）直接组织免疫杂交分析抗原吸附免疫修饰（加入抗体）反应（染色，酶促反应）洗脱观察电子显微镜鉴定法现代电子显微镜(electronmicroscope)的分辨能力可达0.5nm，因此利用电子显微镜观察，比生物学鉴定更直观，而且速度更快。对不表现可见症状的潜伏病毒来说，血清法和电镜法则是惟一可行的鉴定方法。能否观察到病毒，还取决于病毒浓度的高低，浓度低则不易观察到。分子生物学检测法核酸杂交技术（人工标记的病原互补DNA，杂交，显影）PCR技术双链核糖核酸分析病毒复制时以单链RNA为模板合成双链RNA，一般不易被降解。所以一旦植物感染病毒，体内就会存在双链RNA。所以提取待检测样本的总RNA，将DNA和单链RNA降解后，凝胶电泳分析样品中是否有双链RNA脱毒苗的保存与繁殖原原种：脱毒试管苗出瓶移栽后的苗木被称作原原种(initailstocks)，一般多在科研单位的隔离网室内保存。脱毒原原种苗每年应进行一次病毒检测，发现问题即淘汰。检测机构要将病毒检测结果报告有关部门。原种：脱毒原原种苗定植于无土壤线虫、无病源和防虫隔离区内，分株繁殖的第一代植株为脱毒原种苗由脱毒原种苗定植于无土壤线虫、无病源和防虫隔离区内，分株繁殖后代为脱毒生产用苗。脱毒苗的保存离体保存防虫纱网棚室隔离区种植脱毒苗的繁殖继代培养愈伤组织：繁殖最快，繁殖后代遗传性不稳定不定芽：繁殖较快，但有嵌合体的形成丛生芽生根及微型鳞茎的培养隔离区种植第二节园艺植物的离体快速繁殖离体快速繁殖（rapidpropagationinvitro），是指通过无菌操作，将外植体接种于培养基上，在人工控制的营养和环境条件下进行培养，使其在较短的时间内快速地再生出大量的完整植株的方法。第一阶段:建立无菌培养体系主要是为了获得无菌外植体，控制达到无菌条件，以利于植物材料生长，获得愈伤组织或器官，这是整个培养中至关重要的一步。第二阶段:增殖不断分化产生新植株或直接产生不定芽及胚状体，也可根据需要不断反复地进行继代培养，以达到大量繁殖的目的。第三阶段:生根培养将获得的无根试管苗可转移到生根培养基上进行生根培养