药物发现技术

1药物发现技术Techniquesappliedinthedrugdiscovery杜冠华药物筛选中心2药物发现的技术概况•起源：人类主动寻找药物是创造和应用药物发现技术的开始•发展：药物发现技术随科学技术的进步而发展•特点：创造性的应用各学科的知识、技术是药物发现的基本特征•内容：药物筛选技术是药物发现技术主要组成部分3药物发现技术主要类型类型特点现状原始技术尝试不宜使用试验动物技术可靠有效技术成熟体外实验技术提高效率，目标明确技术成熟高通（内涵）量当前重要技术方法发展中生物技术生物药物发展中计算机技术分子设计与虚拟筛选发展中信息技术信息挖掘和信息利用发展中4高通量药物筛选主要研究内容•药物靶点（Drugtargets）基因组学，蛋白质组学，细胞组学提供了条件•筛选技术(techniques)方法创新，技术整合，条件优化•先导评价(Evaluationofleadcompounds)活性评价，ADME/T评价，释药系统评价•筛选策略(Strategyfordrugdiscovery)新学科的交叉，多学科的结合，生（药）物信息学51、药物靶点（Drugtargets）研究基因组学（genomic）功能基因筛选技术，RNAi技术，transgenictechniques蛋白质组学(protenomic)2D电泳技术，疾病相关蛋白，药物差异蛋白，细胞组学(cytanomic)细胞功能信号传导系统研究技术药物靶点研究成为生物、医学、药学研究的热点6基因功能筛选程序基因质粒细胞克隆筛选（时程变化）功能检测表达产物蛋白功能筛选基因蛋白功能7药物靶点（Drugtargets）研究药物靶点研究存在的问题功能基因是否可以成为药物靶点？功能蛋白是否为就是药物靶点？如何判定药物靶点？认识药物靶点是研究药物靶点的关键已知靶点分析8•Figure3.Moleculartargetsofdrugtherapy.Classificationaccordingtobiochemicalcriteria.Basedonamodernstandardworkofpharmacology,themoleculartargetsofallknowndrugsthathavebeencharacterizedassafeandeffectivehavebeencollectedandlistedaccordingtotheirbiochemicalnature(62).•JürgenDrews.DrugDiscovery:AHistoricalPerspective.Science2000;287(5640):1960-1964已知药物靶点生物学分类9已知药物靶点基本特点10药物靶点的基本特点药物靶点根据目前已经认识的约500种药物靶点进行分析，药物靶点必须具备的生物学特征主要表现在以下方面：1、属于生物学大分子（通常为蛋白质），可以单独存在或形成聚合体存在；2、具有可以与其他特定结构的物质（外源性或内源性物质，主要为小分子）相结合的部位或位点；3、该物质的结构可以发生变化，而且是在与具有特异性结构的物质结合后发生变化，正常情况下，这种变化通常是可逆的；11药物靶点的基本特点药物靶点4、该大分子可以通过结构的变化，在生理条件下发挥生理调节功能，引起机体某些功能或表现的变化；5、该物质结构状态变化产生的生理效应在复杂调节过程或作用通路中具有主导作用；6、病理条件下该物质的表达量、活性、结构或特性可以发生变化，这种变化可以是原发性的量变，也可以是继发性的。7、在体内可能存在内源性与之结合的小分子（内源性配基）或外源性配基，其配基具有药理作用且已经被认识。12药物靶点研究的基本过程研究结论：药物靶点（drugtargets）符合全部上述条件候选药物靶点（candidateofdrugtargets）符合除第7条以外的全部条件潜在药物靶点（potentialdrugtargets）符合部分3条以上上述条件功能蛋白（functionalpeotein）符合3条以下上述条件13药物靶点研究的基本过程药物靶点的发现和确证（identificationandvalidation）转基因技术的应用RNA干扰技术的应用配基研究及配基功能研究其他综合技术（靶点确证已成为生物科学研究重点）142、HTS筛选技术•HTS设备的更新(操作系统)样品处理，筛选操作；大规模微量系统152、HTS筛选技术•HTS设备的更新(检测系统)成象检测，数字检测，多层次检测,动态检测（分子、细胞、组织、整体）16HTS筛选技术均相检测体系成为发展趋势•SPA技术的应用•荧光技术的应用FP技术时间分辨荧光能量转移荧光生物芯片技术逐渐成熟高内涵筛选开始应用17++IdealAssaytheoryCompetitivedisplacementFPassay18DetectingparametersLowPolarizationHighPolarizationLowPolarization19TodeterminetheconcentrationofFITC-SR-120Todeterminethetimeofincubationandstabilityofthesignal21Displacementassay22EvaluatingtheFP-basedHTS:Z’value:0.75MaximallyboundFullydisplaced050100150200250300350050100150200250300350WellnumberPolarization(mP)23Screeningresults243、生物芯片技术•生物芯片技术受体蛋白芯片反向蛋白质配基筛选芯片酶活性化合物阵列芯片25Surfacesmodifiedwithpolysaccharidefilm(R)+NaIO4OCH2OHOcH2OOHHOHOHOOHHHHHHHHHnD-Galactose3,6-Anhydro-L-GalactoseOCH2OHOCH2OHOHOHOHOOHHHHHHHHHnOOCH2OHOCH2OHHOHOHOOHHHHHHHHHnHHNROHOH+CH3-O-SiOOCH3CH3CH2-CH2-CH2-NH2OHOHSiOOCH3CH3CH2-CH2-CH2-NH2OOHReactionofmodificationThedesiredcombinationofpropertiesofthemultiplexreceptors26Figure1.FluorescenceimagesofopioidR-μ(A)andandrogenR-LBD(B)microspotsafterincubationwithsolutionscontainingnaloxone-FITCandFluormoneTMALGreenrespectivelyattheconcentrationof1nMintheabsence(i)andpresence(ii)of3%BSAforblockingnonspecificabsorption.(A)(i)(ii)(B)(i)(ii)Smoothingdisadvantageof3Dmatrix27BSALox-1RFigure3.Lox-1receptorfunctionalproteinmicroarraysandtheSignaldensitydependenceofconcentration.TheSignaldensityofDil-LDL(fixedconcentrationis0.04mg/ml)inmicrospotsareshownfordifferentconcentrationsofLox-1receptor(2,1,0.5,0.25,0.125mg/mlfromlefttoright).Concentrationdependenceassay28Figure4.SaturationprofilesofadrenergicR-β2withTMR-CGP12177.Rainbowcolors(blue~red)symbolRFU.(i)RFUoftotalandnonspecificblocksincubationwithTMR-CGPinconcentrations(5~0.02nM)intheabsenceandpresenceofunlabeledpropranolol(1μM).(ii)Dose-dependencecurveiii)ScatchardanalysisforestimationofthedissociationconstantforCGP.0.00.51.01.52.00255075100nonspecifictotalspecificC(nM)RFUsaturationcurveanalyztion0.00.51.01.52.0010203040506070BF(nM)B(RFU)Scatchard0255075050100150200250y=-2.5903x+207.88R2=0.8Kd=0.386nMBoundBound/Free(i)totalnonspecific29Figure5.Saturationexperimentdemonstratedbymembranereceptor,opioidreceptor-μ.(i)Fluorescenceimagesafterincubationwithnaloxone-FITCatdifferentconcentrations(0.2048~20nM)intheabsenceandpresenceofunlabelednaloxon(1μM).(ii)Dose-dependencecurve.iii)Scatchardplot.(i)totalnonspecificopioidR-saturationcurve0.02.55.07.510.012.515.017.520.022.501020304050C(nM)RFUScatchard0102030405005101520253035y=-0.6477x+29.134R2=0.9068Kd=1.54nMBoundBound/FreeopioidR-saturationcurve05101520250255075100totalnonspecificC(nM)RFU30Figure6.Nuclearreceptorestrogenreceptor-β.(i)Fluorescenceimagesafterincubationwithsolutionscontainingestradiol-BSA-FITCatdifferentconcentrations(0.2048~20nM)intheabsenceandpresenceofunlabeleddiethylstilbestrol(1μM).(ii)Plotofthefluorescenceintensity.iii)Scatchardplotforestradiol-BSA-FITC.EstrogenR-saturationcurve0.02.55.07.510.012.515.017.520.022.50255075100125specificC(nM)RFUScatchard0501001502000102030y=-0.1679x+25.734R2=0.9465Kd=5.96nMBB/FestrogenR-saturationcurve0510152025050100150200250300totalnonspecificC(nM)RFU(i)totalnonspecific31androgenR-LBDsaturationcurve0.02.55.07.510.012.515.017.520.022.50510152025nonspecificKd=0.63nM