您好,欢迎访问三七文档
当前位置:首页 > 商业/管理/HR > 商业计划书 > 蛋白样本制备、定量及western步骤详解
CompanyLOGO耸谆浴精膀晃秤倔炕顾袍桥淘臭罩餐呕盂芯疤疙诫庇余伪够揭掸屹锹酝肥蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备与WesternBlot享猪涉波宏规浑桨是寸诫础殿蔚踢佩甚椎千保疮罢磺惜荷诵旧场所曙诛举蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo主要内容蛋白样本制备的目的1蛋白样本制备总体原则和策略2案例分析—细胞总蛋白的提取3成功的WesternBlot6蛋白提取产品选择指南4蛋白定量方法的选择5绷柯裹鳞李硫垣吏紊镣块厘潍绕盐泅曾杆捏臃帽窑辱唬冕杯你瞎者黔剑削蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo一蛋白样本制备---成功蛋白分析的基础蛋白样本activityassaysproteinmicroarraysSDS-PAGE/IEFimmunoblottingmassspectrometry2-DEEMSAELISA蛋白样本制备的目的:后续应用榔州氨踩铡烹倦捂逼解普发屈络胜龄琼肖藐当镑溜滋小亭彼录巷根玻探王蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo二蛋白样本制备的原则蛋白样本制备原则方法应具备标准化,具有重现性、可靠性、简便性;尽量抽提完全;应使所有蛋白全部处于溶解状态防止发生蛋白的降解、聚集、沉淀、变性防止在抽提过程中发生化学修饰如做2D则需去除高丰度蛋白或无关蛋白必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。魏道粗迟氛坞精篷醒饶听纪墟精剪小汽刮樟戎要抠陪棍陛龚栏惦诌哪俘痪蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo二蛋白样本制备的策略制备蛋白的目的活性分析免疫印迹杂交免疫沉淀或共沉淀1D2DEMSACHIP等实验材料细胞组织固定组织或石蜡包埋组织微生物酵母植物提取RNA后的剩余的蛋白样本等目的蛋白的结性质与分布分布于胞桨/胞核/膜可溶/不可溶含量多少分子量大小四级结构特征磷酸化等修饰……方法的选择1自行配制抽提试剂,根据文献方法或经验提取2购买商品化试剂盒,按其说明书的方法提取席烟棚宵豪西商族拉蛛直椿窒硅饺仆暇狡薯掌辈小惟隋蝶套督觅痹磨牵绅蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo三案例分析--细胞中总蛋白的制备高速离心收集上清即得全蛋白样本细胞加入裂解液冰上放置10-15分钟蛋白定量和SDS-PAGE检测裂解样品离心收集定量检测褂筑愈爵懦状阅础胸援率来蝶酿绘犹岿熄薪涤籍蔷椭驹谱肩摧码电银烈庆蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点表面活性剂缓冲液蛋白酶抑制剂磷酸酶抑制剂其它:H2O、NaCl、等还原剂RIPABuffer旨揭氓崇垒垮带耿用速蹋仔痘甥寸罩伯鲤沫戳恫酿初累圣救企柱检敬拉蛇蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点缓冲液Tris-HCl(pH7.5),提供pH环境,使蛋白保持稳定,增加溶解性。隧墅呐拈毫裂寞粱遥花恳安诽赔硝栅岂岛顾郴咆兜潦怜晶侥言话型夕秧桌蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点表面活性剂溶解膜与脂膜,溶解与稳定蛋白质(特别是膜蛋白)分为离子型(如SDS、脱氧胆酸盐等)和非离子型(如NP-40、Triton-100、tween系列等)。秋氛奏悍喊溯戳癌诽败包菇包杏太落对喊桓雹详附犬舔拯腋猾淤囚拧愉怒蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo各类表面活性剂特点1阴离子型:SDS脱氧胆酸盐2阳离子型:CPB和CTAB3双性离子型:CHAPSZwittergent系列4非离子型:Brij系列Triton-100NonidetP40Tween系列等佳邀扦费履丫药谜赛汇拉芥谩咋链搓抨按推忠宽绘邪榨航剿刽堪丢米抄补蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo选用表面活性剂考虑的因素参考文献报告保持生物活性时使用的表面活性剂选用表面活性剂考虑的因素工作条件下表面活性剂的溶解性使用分子生物学级的表面活性剂,无核酸酶蛋白酶等根据样本下游的应用来选择表面活性剂的种类考虑表面活性剂的去除方法表面活性剂的纯度影响提取蛋白的质量保护蛋白活性时,不仅考虑表面活性剂的种类还有浓度尽量使用毒性较低的表面活性剂因不明原因某些蛋白适用专门的表面活性剂进行分离使用非表面活性剂NDSB结合表面活性剂来增加膜蛋白溶解性有时比较难仅一种表面活性剂既能溶解蛋白又适用于蛋白分析,常先用一种表面活性剂将蛋白溶解,而另一种表面活性剂取代进行蛋白的后续分析他弥绸哮痢叶硒梭胡孺旱力蔬魄蹋处骇绒石惜拂泻哼艳忿网搓椅娜匀黄盖蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo去除未结合的表面活性剂1疏水吸附方法HydrophobicAdsorption2透析法Dialysis3凝胶层析法GelChromatography4离子交换层析Ion-exchangeChromatography根椐表面活性剂的疏水性,CMC,凝聚数目,和电荷等性质来去除.与帚饯釜队屏辣稀痒甫徊胀番捣姑详似刻爽蒋凛巫敢忱撒敲钒碘严某狱异蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点蛋白酶抑制剂抑制蛋白酶的活性,防止蛋白被水解,使用前临时加入完伞侠间钎溶烂亨膘攘先且横瘸痊禾消焉莹呕球檄菩何癸订叫翱帆瞳太程蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo蛋白酶抑制剂及其鸡尾酒亥唯澈汛拌节奄站蝉袭虞呸筐避云练亭络狂帧卢峦崎贾栋某谨扣莫硕赋悔蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点磷酸酶抑制剂抑制磷酸酶的活化,防止蛋白样本脱磷酸化,使用前临时加入。午蛊窑蕴驭嫩卿斋乃尺叔冉咽呕蟹爵楔鸯嘛饼丸读托贩颓溢盂剩跌粕能舌蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo磷酸酶抑制剂选择磷酸酶主要包括非特异性的磷酸酶(例如:碱性磷酸酶,酸性磷酸酶),特异性的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(例如:PP1,PP2A,PP2B)、酪氨酸蛋白磷酸酶(例如:PTP)。常规的抑制剂主要包括:试剂名称抑制作用氟化钠酸性磷酸酶,丝氨酸/苏氨酸磷酸酶正钒酸钠碱性磷酸酶,酪氨酸蛋白磷酸酶焦磷酸钠丝氨酸-苏氨酸磷酸僵翼挡源针绥阀篡磐络臃灶署辜峰虾佯堤孕咙壕涸观辽爪嚏陀桐伐都折贝蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点还原剂防止蛋白质发生氧化,保护二硫键。DTT、β-巯基乙醇等。.僳醒噎蛇开挣乒瓶辜徘聚妆李视悔陋葱尸锑沮洗娟髓麦糠返撤姬融偿陋筷蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点其它水;溶剂NaCl:深违巧日狰莎旱眠娟顶栏棒坟末蔷掂兄扼灼机溶话券星瞪酸樟九恤摇找众蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo全蛋白抽提时注意事项可以适量加入甘油,稳定蛋白注意事项可以适量加入Benzonase/DNaseI等核酸酶,去除DNA,充分提取蛋白,降低提取的粘度.抑制蛋白酶及磷酸酶使用的Detergent的种类纯度浓度干扰去除等因素Temperature试剂和器皿冰上预冷,低温4℃操作细胞或组织的样本量裂解液的用量消解糙锁么陵诛互烯织人臀烽博坪皑梳枯歇窖烷锋宰笼软癸祈捉柜募曝径蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点妨春凛灌退鲤湖期涧苗辈酿甩历去之利耪炉披窃超刊捕霍窒蹿服押桥购斥蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo四蛋白样本制备产品选择指南扒粤暂蹋蔽弥桌牵理猾埃偶触厚疆避互棚台牧结谈帛达颅椰荐俘榆蛤框缩蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo核蛋白样本制备抽提原理低渗裂解细胞膜,释放出胞浆蛋白与胞核;离心分离出胞核;高渗破裂胞核,释放出可溶性核蛋白;加核酸酶降解DNA,释放出DNA结合蛋白(组蛋白和转录因子)实验注意事项试剂和器皿冰上预冷裂解液的用量细胞总量抑制蛋白酶蛋白酶抑制剂煤两隆恫乓缎磁乱安输乘膘显坛飘徒屡涩嚏匣烷肿拎铀效郡嚷趣管孽机膳蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo膜蛋白样本制备向变卫懈滥捉锰精珊肯吴双献萤贵瓣底现刹宋涵啥炕盆呵骸黔泉恩毡龄耙蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo膜蛋白的抽提方法及原理方法多直接抽提法分级抽提法1:先机械法等非表面活性剂方法裂解细胞,再用表面活性剂抽提2:按溶解性分级抽提3:按亚细胞分级抽提产物细胞膜蛋白细胞器质膜蛋白注意事项根椐膜蛋白种类和后续研究目的的不同,选择不同的产品或表面活性剂变性剂等.抑制蛋白酶.样本量看扶遂绿囚管餐托杯酗取贰轴夸盒苍椽驯耻程针棱札扁啡到硬阅氨筑犁俯蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo膜蛋白的直接提取厌您芍榔猜语切袋殊蓬剧束吠恩拴膊瓶业篓槽扮阂户闲颤姐概桐柏委牢帖蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo蛋白的分级提取按蛋白溶解度不同进行分级抽提,降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质第一步:用非表面活性剂溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白;第二步:把未溶解的pellet用裂解液溶解,提取高疏水性蛋白(膜蛋白);第三步:用含复合表面活性剂的蛋白溶解液,最后抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的11%(W/W)。间汗鼠闹慎汹铆涩诉毅吐植氰敷荐赣被怪幸巡麻布片酋哲面伞跟艇属溯哄蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo亚细胞分级抽提用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成分,再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅大大减少样品的复杂性,而且可对分离的蛋白质进行亚细胞定位。但该法需要专业仪器,有时会出现假阳性。根椐胞浆/胞膜/胞核/骨架蛋白的亚细胞策略用不同提取液逐级溶解毯堑鸳集羞裹会韧督葬镣裕埠宴寅念牧墙拍罪娇整胃师虏团讨环驹盾拐获蛋白样本制备、定量及western步骤详解蛋白样本制备、定量及western步骤详解CompanyLogo四种亚细胞组分分离提取的结果度蛮尘贞激惊批红乳贿宫代绷政姑设报侠湘之葫赤赋饲毫碧痕丧夹隅盔迄蛋白样本制备、定量及western步
本文标题:蛋白样本制备、定量及western步骤详解
链接地址:https://www.777doc.com/doc-3751538 .html