2017春 植物生物技术实验指导 (自编) -1

1生物工程综合实验—植物生物技术模块生物工程教研组编2017年春学期2目录实验一植物组培实验室设计和实验设备、实验用品认知.......3实验二MS培养基母液的配制.....................................................6实验三MS培养基配制与灭菌.....................................................9实验四无菌接种操作.................................................................12实验五外植体分化生长的诱导培养.........................................12实验六外植体脱分化生长的诱导培养.....................................17实验七组培苗的炼苗.................................................................203实验一植物组培实验室设计和实验设备、实验用品认知一、目的与要求1、结合对植物细胞工程安徽省工程技术研究中心植物组织培养生产车间和研究实验室的现场认知，了解掌握植物组织培养实验室的组成和所需的基本仪器设备，学会植物组织培养实验室的设计；2、为后续植物组培实验课程学习与实训准备所需的相关用品。二、教学场所1、植物细胞工程技术研究中心；2、生物工程综合实验分室（A514）。三、内容与方法（一）关于植物组培实验室的认知与设计1、组培实验室设计原则要求环境干燥清洁；符合无菌操作规程要求；满足生产技术流程需要。2、组培实验室的一般组成与设备包括化学实验室、洗涤准备室、培养基制备室、无菌操作室、培养室、细胞学观察研究室，等。（1）化学实验室各种相关药品的贮存、溶液配制等。主要设备：药品柜，防尘橱，冰箱，天平，蒸馏水发生器，加热器（电磁炉等），玻璃器皿，等。（2）洗涤准备室用于完成相关器具的洗涤、干燥、堆放存储等。主要设备：洗涤池，洗瓶机，操作台，烘箱，储物架（柜）等。（3）培养基制备室4用于进行培养基的生产。主要设备：冰箱，天平，蒸馏水发生器，酸度计，加热器（电磁炉等），玻璃器皿，分装机，灭菌设备，操作台，等。（4）无菌操作室主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的继代等。无菌室的房间不宜太大，数量根据需要设置。要求干爽清洁，相对密闭，墙地光滑防潮，配置平移门。每一无菌室设内外二间，外间为缓冲室，内间较大，为接种室。主要设备：紫外灯，超净工作台，臭氧发生器，酒精灯，接种器械（镊子、剪刀、解剖刀、接种针），手推车，等。（5）培养室是将接种的材料进行培养生长的场所，大小依规模而定。培养室的设计以充分利用空间和节省能源为原则。主要设备：空调机，加热器，增湿器，培养架，光照设备，培养箱，转床，人字梯，等。（6）细胞学观察室用于进行培养物的取样观察和分析。主要设备：显微镜，细胞染色、计数、制片设备，天平，离心机，等。（二）组培实验用品的准备1、玻璃器皿及规格（1）培养瓶：100~500mL的玻璃或塑料培养瓶等；（2）培养皿：9～15cm；（3）烧杯：100～5000mL；（4）量筒：10～1000mL；（5）移液管：1～10mL；（6）试剂瓶：100～1000mL；（7）容量瓶：100～1000mL。2、接种器械酒精灯，不锈钢镊子、剪刀、解剖刀等。53、其它用品培养瓶封口膜（盖），棉线，记号笔，打包纸（牛皮纸、报纸），转运筐，等。四、预习思考与作业1、试分析植物组培苗工厂化生产的车间设计与设备选型。2、分组准备（领取、洗涤、保管）植物组培实验主要用品。6实验二MS培养基母液的配制一、目的与要求1、了解植物组织培养培养基的组成，常用配方；2、掌握培养基配制的步骤，母液的概念与配制方法。二、教学场所生物工程综合实验分室（A514）。三、内容与方法（一）基本原理植物培养基配方中的成分多样，为减少每次培养基配制的工作量和误差，有必要将配方中的成分分为几类，分别配制成若干浓缩倍数的母液备用。（二）实验内容完成MS培养基各种母液的配制。四、材料与用品（一）主要化学试剂和药品详见表1。（二）仪器用具天平、烧杯、试剂瓶、量筒、容量瓶、蒸馏水器、加热器、电冰箱，等。五、实验操作（一）MS培养基的基础配方与母液配制1、MS培养基的配方和母液配制用量详见表1。2、配制1L培养基所取母液的量配制1L培养基，所取上述各种母液的数量为：大量元素和钙盐母液各750mL，铁盐、微量元素和有机物的母液各10mL。铁盐配制：将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别放到450mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将Fe盐溶液倒入EDTA溶液中混合，并将pH调至5.5，最后定容到1L，保存在棕色玻璃瓶中。CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O因量较小，应先配成更高浓度250mg/L的母液(10000×),再根据母液体积取用。（二）植物激素的母液配制6-BA、NAA、2,4-D等常用植物激素，可配制成0.1mg/mL的母液，单独配制和取用。配制时，6-BA、NAA、2,4-D等，可先用少量1MNaOH再加入热水定容。表1MS培养基的母液配制方法参考表母液序号母液名称配方成分分子量配方用量（mg/L）母液倍数配制1L母液称取量（mg）I大量元素NH4NO380.04165020×33000KNO3101.11190038000MgSO4·7H2O246.473707400KH2PO4136.091703400CaCl2·2H2O147.0244020×8800II微量元素KI166.010.83100×83H3BO361.836.2620MnSO4·4H2O223.0122.32230ZnSO4·7H2O287.548.6860Na2MoO4·2H2O241.950.2525CuSO4·5H2O249.680.0252.5CoCl2·6H2O237.930.0252.5III铁盐FeSO4·7H2O278.0327.8100×2780Na2·EDTA372.2537.337308IV有机物肌醇100100×10000甘氨酸2200盐酸吡哆醇(VB6)0.550盐酸硫胺素(VB1)0.110烟酸0.550注意事项：（1）钙盐、铁盐单独配制。铁盐需要用棕色试剂瓶盛装。（2）烟酸在冷水中溶解度差，称量后可先单独用适量热水溶解后，再加到相应的母液中一起定容。附：MS培养基是目前使用最普遍的培养基。其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不会影响离子间的平衡。MS固体培养基可用于诱导愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花药的培养，其液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显的成功。MS培养基的无机养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要。因此，一般情况下，不用再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有机附加成分。和其它培养基的基本成分相比，MS培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量高，这是它的显著特点。六、预习思考与作业1、MS培养基配方中，CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O的用量小，配制母液时直接称量相对较困难，如何操作可减少此困难并降低误差？2、配制浓缩倍数较高的大量元素母液时，为何往往会发生沉淀，如何避免？3、表1中的试剂，有的含有结晶水，假如提供的试剂的结晶水的个数与配方中的不一样，应如何处理？9实验三MS培养基配制与灭菌一、目的与要求1、学习掌握植物组培培养基（含分化诱导培养基）的配制方法与流程；2、了解、掌握培养基高温高压灭菌的方法与流程；二、实验内容1、设计和配制用于诱导和增殖的培养基；2、外植体消毒所需用品的准备。三、教学场所生物工程综合实验分室。四、材料与用品（一）主要试剂和材料已配制的MS各种母液，蔗糖，琼脂粉，HCl和NaOH自选。（二）仪器用具天平、烧杯、玻棒、量筒、移液管、培养瓶、电磁炉、平底煮锅、酸度计、培养皿，等。五、实验操作（一）培养基的配制设计并配制用于诱导和增殖生长的培养基。1、培养基的基础配方MS+蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L（以下简写为MS）2、诱导培养基中的激素组合分化生长培养基1)MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L102)MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L3)MS+6-BA0.1mg/L+NAA2.0mg/L4)MS+6-BA0.2mg/L+NAA2.0mg/L脱分化培养基1)MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L2)MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L3)MS+2,4-D1.0mg/L+6-BA1.0mg/L4)MS+2,4-D0.5mg/L+6-BA0.5mg/L3、培养基的制备（1）以实验小组为操作单元，每小组20瓶（每瓶分装量约50mL），计算所需培养基的总体积；然后根据培养基的总体积，计算和称取琼脂粉、蔗糖，量取各种母液存放于烧杯中。（2）量取约为培养基总体积2/3比例的纯净水，放入煮锅，置于电磁炉上，加入琼脂粉，加热并不断搅拌，直至琼脂粉完全融化、澄清透明。（3）加入蔗糖并搅拌至融化；倒入已量取好的母液，搅拌混匀；倒入大容器，补加纯水定容至预定的体积数。（4）取样，用酸度计测pH值；用1M的HCl或NaOH溶液调节pH值至6.0左右。（5）各实验小组分别按照选定的一个激素组合，计算并用移液管吸取加入相应的激素母液，混匀。（6）分装到培养瓶，封好瓶口，作好分组标记。（7）高压湿热灭菌；冷凝备用。（二）外植体消毒所需用品的准备1、外植体消毒所需的用品无菌水，灭菌后的500mL烧杯、15cm培养皿以及吸水滤纸，等。112、消毒用品的准备用750mL兰花培养瓶盛装自来水或纯水（装水体积不得超过培养瓶容积的2/3），封口；玻璃器皿（500mL烧杯，15cm培养皿等）、吸水滤纸等，分别用牛皮纸或报纸打包捆扎好。然后，进行高压灭菌。灭菌完毕后，取出，烘干表面水分，转移到无菌室储物架上存放备用。注意事项：（1）培养基分装时，尽量不要沾到瓶口，若有沾染要擦除后再封口；灭菌和转运时，培养基不能过于倾斜，以免瓶口部位沾染培养基，容易造成后期染菌。（2）使用高压灭菌锅时，一定要先检查锅底水位。灭菌完毕开盖取物时，要避免被烫伤。六、预习思考与作业1、了解植物组培常用的植物激素种类，各类激素对植物离体培养物的生理作用和效应。2、实验室高压灭菌的基本操作步骤如何？哪些因素可能会影响高压灭菌的实际效果？12实验四无菌接种操作过程一、目的与要求1、、以草本或藤本植物为材料，学习外植体消毒和无菌接种操作方法；二、实验原理植物组织培养技术是植物生物技术的基础。植物组织培养的基本原理是植物细胞的全能性（totipotency）。无菌操作是植物组培的基本要求。三、教学场所植物细胞工程技术研究中心组培室。四、材料与用品（一）实验材料草本或藤本植物的茎尖，芽尖或茎段。（二）培养基已分组配制好的培养基。（三）主要试剂70%～75%乙醇，0.1%升汞（HgCl2），等。（四）用品用具超净工作台，酒精灯，酒精棉球，无菌水，已灭菌的500mL烧杯、15cm培养皿，接种用工具（医用剪刀、镊子、手术刀具），废液杯，工作帽，口罩，工作服，记号笔，等。五、实验操作（一）外植体的预处理先将外植体在加入少量洗洁精的自来水中清洗表面，沥水，然后放入烧杯，带进接种室。（二）无菌室消毒13接种操作前半小时，先将培养基、无菌水、烧杯、培养皿、外植体材料等有序放置在超净工作台上，打开紫外灯（不开照明灯）进行空间消毒；20min后，关闭紫外灯（仍不开照明灯），开启超净工作台；至超净工作台运行10min后，进入无菌室操作。（三）外植体的消毒操作者坐在超净工作台前，用酒精棉球擦拭双手和手臂，蘸酒精灼烧托盘、剪刀、镊子等接种工具。先将外植体材料转入一只无菌烧杯，用7