药理学试验五-中国医学科学院

AC活性测定相关背景实验原理实验步骤问题讨论BackgroundReviewcAMP是多种激素、神经递质等作用于细胞时的第二信使物质。由腺苷酸环化酶AC催化ATP分解而成。ATPcAMP＋ppiACBackgroundReviewcAMP生成以后又在环磷酸腺苷酸二酯酶（PDE）的作用下分解失活。这样AC和PDE共同维持体内的cAMP的动态平衡。cAMP的浓度与细胞效应密切相关，因而调节AC以及PDE的活性即可以影响细胞的功能，其中AC活性的调节乃多种受体激活产生细胞效应的中心环节之一。BackgroundReview中枢神经系统中存在多个多巴胺效应系统，其中尾状核是多巴胺受体分布较为丰富的区域，其作用与调节锥体外系的功能有关。多巴胺与细胞表面的受体结合，通过影响AC活性而发挥作用，很多抗精神病的药物是多巴胺受点的拮抗剂，这些药物不仅能抑制多巴胺与受体的结合，而且也抑制AC的活性。AC活性测定相关背景实验原理实验步骤问题讨论Principle本实验采用非标记底物法测定AC活性。即用非标记的ATP作底物，其被AC催化所形成的cAMP可以不经过分离通过蛋白竞争结合法直接进行含量测定，方法简便灵敏度高。非标记底物测定cAMP浓度，间接推测AC活性的大小，同时观察多巴胺和氟哌啶酶对AC活性的影响。AlfredG.GilmanAC活性测定相关背景实验原理实验步骤问题讨论Procedure配制标准cAMP浓度梯度：母液100ulT.E32pmol/100ul16pmol/100ul8pmol/100ul4pmol/100ul100ulT.E100ulT.E100ul100ul100ul100ul母液100ulT.EProcedure取小试管10支，依次编号，置试管架中。按下表加入各种试剂123456分组编号Tris苹果酸缓冲液200μM多巴胺μl250μM氟哌啶醇μl10mMATPμlA1－2350————50B3－4350————50C5－630050——50D7－8300——5050E9－10250505050Procedure开动计时器，同时向第一管中加入大鼠尾状核匀浆液，100μl，摇匀。每间隔10s，向下一管中加入大鼠尾状核匀浆液，100μl，摇匀。1－2管：立即置沸水浴中，煮沸5min。取出，置冰浴中，10min。Procedure分类分组编号TEμl标准品cAMPμl待测样品μl3H－cAMPμl结合蛋白μl摇匀，4摄氏度放置2小时活性炭μl10000rpm离心5min，取上清200μl，测定放射性。比较管CT1－2250——50——B3－4150——50—100C05－6100——5050100标准管S17－8—100—5050100……………………S719－20—100—5050100样品管A23－24——1005050100B25－26——1005050100C27－28——1005050100D29－30——1005050100E31－32——10050501004000rpm离心5min，各管取上清100μl按下表加样Procedure然后加活性炭混悬液，立即12000rpm离心5min。小心吸取上清200μl，转入液闪瓶中，加5ml闪烁液，加3ml无水乙醇。（本实验中为已经配好的混合液，吸取两次，每次4ml即可）加盖摇匀，过夜。测闪烁计数AC活性测定相关背景实验原理实验步骤问题讨论Discussion本实验为微量实验，所以加样等操作精确度对结果影响很大–各管加样准确–各组时间平行Discussion加入活性碳后应立即离心因活性炭对游离3H-CAMP的吸附存在动态平衡，吸附时间过长可能造成反应产物的解离，影响试验结果。DiscussionBSA的作用？加入ATP的作用？加入无水乙醇的作用？加入沸水浴的作用？倍比稀释的优点与缺点？分析可能影响试验结果的因素，并讨论如何控制这些因素优化试验Discussion根据药理学的理论知识预测试验的结果；用合适的方法分析并解释你自己得到的数据和结论。谢谢大家就讲这么多