土样中淀粉降解芽孢杆菌的筛选

土样中淀粉降解芽孢杆菌的筛选第七组王孝廉钱晟东孟龙许瑞琪实验方案一、实验目的二、实验材料三、实验原理四、实验步骤五、时间安排一、实验目的掌握土壤样品中微生物菌种分离和筛选技术的实验设计方案。掌握富集、平板稀释涂布法、分离筛选产淀粉酶菌株的基本原理。初步掌握从土壤样品中分离筛选产淀粉酶菌株的基本技术。二、实验原理淀粉酶能使淀粉分解成葡萄糖，而淀粉与碘液发生反应形成蓝色化合物。葡萄糖不与碘液发生反应形成蓝色化合物，结果可使淀粉酶产生菌周围形成透明圈，从而筛选出淀粉酶产生菌。芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。增殖培养是通过控制培养基的营养成分和/或培养条件使样品中的目的菌得以大量繁殖,而非目的菌的生长受到抑制或繁殖减缓,从而提高样品中目的菌的数量和比例。初筛是对所得的纯种进行检测。由于淀粉酶是胞外酶，在分离培养基中加适量可溶淀粉通过平板透明圈法来检测淀粉酶产生菌。筛选透明圈比值大的菌株接种到培养基中进行培养，再进行复筛。三、实验材料土壤样品：实验前一周在距土壤表层8-10厘米左右处填埋馒头，实验前一天用塑料袋在预处理除取样。富集培养基：蛋白胨1%NaCl0.5%可溶性淀粉0.05%PH7.2~7.4选择培养基：蛋白胨0.5%NaCl0.5%可溶性淀粉1.0%琼脂2%葡萄糖0.1%PH7.2~7.4玻璃仪器:培养皿12副，试管10支，三角瓶6个，移液管10支（1mL710支,5mL3，10mL3支），100mL量筒2个,玻璃棒，玻璃珠。试剂：草酸铵结晶紫染液，95%乙醇，番红水溶液、碘液其它：酒精灯，硅胶塞,包装绳，包装纸,PH试纸，接种环，电子天平，称量纸,高压蒸汽灭菌锅，摇床，角匙，记号笔等。四、实验步骤1.样本采集2.培养剂的制备3.增殖培养4.初筛：5.菌种鉴定。1、样本采集在预埋处采取土样用塑料袋装好，不要损坏土壤的内部结构。2、培养基的制备（1）富集培养基：称取蛋白胨1.0g、NaCl0.5g、可溶性淀粉0.5g溶于装有100mL蒸馏水的三角瓶中，调pH为7.2至7.4，分装为2个三角瓶,50mL/个,包扎，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。（2）筛选淀粉培养基：称取蛋白胨1.0g，NaCl1.0g，可溶性淀粉2.0g，溶于装有200mL蒸馏水的三角瓶中，再加入4.0g琼脂粉并搅拌至充分溶解，调pH为7.2至7.4，包扎，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。3、增殖培养称取土样15g，倒入盛有40mL无菌水的带玻璃珠的三角瓶中，摇床振荡30min制成土壤悬液,用无菌移液管分别吸取10mL土壤悬液加入液体培养基中,置于37℃的恒温培养箱中培养24h。将培养基在85℃-90℃水浴锅中加热10分钟，杀灭菌体，使芽孢得到富集。4、筛选方法一：浇注10块平板培养基。取增殖培养后的菌液标记为10－1。用无菌移液管吸取10－1的菌悬液1mL放入装有4.0mL无菌水的试管中吹吸数次混匀即为l0－2稀释液，照此分别制成l0－2～l0－6的稀释液。将10-2～10-6土壤稀释液1mL涂布于平板培养基表面,每一稀释度涂布接种两块平板。倒置于37℃的恒温培养箱中培养24h。待长出菌落后，滴加碘液，挑取有明显淀粉水解圈的单菌落。方法二：浇注2块平板培养基。取增殖培养后的菌液在培养基上划线，将平板倒置于37℃的恒温培养箱中培养24h。待长出菌落后，滴加碘液，挑取有明显淀粉水解圈的单菌落。5、菌种鉴定选取水解圈的菌落通过观察其菌落的大小形态以及对其菌体进行革兰氏染色以及芽孢染色等进行鉴定。（目标菌落加碘后又变色圈，特征为扁平、边缘不整齐，白色，表面粗糙有褶皱。革兰氏染色显阳性。）五、时间安排周一玻璃仪器灭菌，培养基制备，周二取样，富集培养周三杀菌，接种芽孢，选择培养周四检测，染色制片，继续培养周五选择最优菌株参考资料深度/CM细菌放线菌真菌藻类3-897500002080001190002500020-25217900024500050000500035-40570000490001400050065-751100050006000100参考资料参考资料[1]周德庆.微生物学实验教程，北京：高等教育出版社，2002.9[2]闵航.微生物学实验[M].浙江大学出版社，2005,2月第17卷第2期:34-37[3]史永昶等.蛋白酶对解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶活力的影响[J].微生物学通报,1995,22(1):23～24.[4]钱存柔等微生物学实验教程，北京大学出版社，第二版。