辅酶Q10与拉贝洛尔联合用药对自发型高血压大鼠治疗效果的研究

开题报告：辅酶Q10抗脂质过氧化作用对SHR大鼠高血压的防治研究02级法文班徐呈兰晓曦庞文璟解轶声林盟菲孟晋方原吴贻明指导老师：李稻实验目的：探究、比较单用辅酶Q10以及辅酶Q10与拉贝洛尔协同作用对SHR大鼠的血压升高的抑制或降压的作用，并对辅酶Q10的降压作用机制进行初步探讨。实验意义：高血压是一种常见、多发病，原发性高血压的病因不详，但与遗传因素和环境因素密切相关，所以对高血压高危人群的防治工作尤为重要。新近发现脂质过氧化反应可能参与了高血压发生和发展的病理过程[9]。但也有报道认为，辅酶Q10具有较好的抗脂质过氧化的作用[8]。本实验利用血压未达平台期的SHR大鼠模拟高血压高危人群，并初步研究辅酶Q10以及辅酶Q10与拉贝洛尔协同作用对高血压防治的效果，探索临床用药的新途径。技术路线：SHR大鼠测血压、心率取血，冷冻保存配对分组实验组大鼠：CoQ10对照组大鼠：生理盐水15天后肌肉注射拉贝洛尔，测血压、心率处死动物，取血，测指标，心脏称重数据分析、讨论结果实验动物：ＳＨＲ大鼠（雄性，10周龄，１２只，随机分为：对照组和实验组）动物来源：中国科学院动物实验中心实验器材：1B型RBP大鼠血压计、i-STAT型血气电解质分析仪、725型分光光度计、80-2台式离心机、旋涡混匀器、水浴箱、研磨器、分析天平（0.1mg）、可调式Eppendorf移液器、鼠台、量筒、试管、注射器、常用手术器材、保鲜薄膜等。检测试剂盒：丙二醛（MDA）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（南京建成生物工程研究所）一氧化氮（NO）测试盒（南京建成生物工程研究所）实验药品：生理盐水：作为安慰剂，上海第二医科大学病生教研室提供辅酶Q10胶囊：上海信谊制药公司拉贝洛尔：江苏天禾制药公司无水乙醇、冰醋酸用量：辅酶Q10：20mg/day服用15天。拉贝洛尔：小剂量具体用量在预实验后确定。实验方法与操作步骤：１．12只大鼠稳定两天，每天测一次血压（1B型RBP大鼠血压计），使大鼠习惯。根据大鼠血压配对后随机分成两组。（随机数法）２．两天后，眼球取血1.5ｍl于试管。静置后离心（3000rpm×10min）取上层血清，再一次离心（5000rpm×5min）取上清液，-20C冷冻待用。３．实验组大鼠灌胃辅酶Q10（20mg/day）15天，对照组大鼠灌胃安慰剂（生理盐水）15天。灌胃溶液自行于灌胃当天调配，灌胃液为20mg/3ml生理盐水。４．每隔5天测量并记录血压、心率。５．第15天，测完血压、心率后，肌肉注射拉贝洛尔（剂量待定），于30min后测量并记录血压和心率。６．乙醚麻醉动物，处死动物，称重。用大剪刀开胸，即刻用注射器从心脏抽血，将针头对准电极板注血口，注入全血到标准刻度，盖上小盖，插入i-STAT血液分析仪器，分析并记录血液中钾离子。最后再取血1.5ml于试管中，血液静置后离心取上层血清，将15天前冰冻的血清取出，化冻，两份血清一起做丙二醛、SOD、NO检测（方法详见试剂盒说明书）并记录结果。７．取出心脏，清理、称重，计算：心重（g）/体重（g）。８．运用配对T检验的方法，对数据进行统计学分析。预期结果：1．服药15天后，对照组和实验组大鼠平均血压有明显差异，说明辅酶Q10对SHR大鼠有降压作用，推迟其血压达平台期的时间（统计学上有意义）。2．拉贝洛尔+辅酶Q用药时，可降低拉贝洛尔的剂量，达到降压效果，或延长药效维持时间。StudyGroupΔBP15天后，肌注拉贝洛尔后，实验组对照组大鼠平均血压变化(n=6)0ControlGroupControlGroupStudyGroupBP服用药物15天后，实验组对照组大鼠平均血压、心率比较（n=6)HRControlGroupStudyGroup3．血清中MDA浓度：服用辅酶Q10后明显下降；SOD浓度：服用辅酶Q10后不变；NO浓度：服用辅酶Q10后明显升高。证明辅酶Q10的降压机制为抗脂质过氧化。4.实验组和对照组由于血压不同而使心脏负荷不同，导致心肌增生程度不同，表现为心重不同。可能遇到的困难和问题及解决的措施1经费有限，无法做大样本量的药效试验，为使实验结果有统计学意义，我们将动物数量控制为12只，并进行配对，尽最大可能使结果有说服力。2小组成员对实验操作经验不足，对于大鼠灌胃、测血压等操作比较陌生。但在动物房老师的耐心指导帮助下，将会顺利完成实验计划，并对动物实验的基本技术有感性认识。辅酶Q10实验组与对照组心重/体重值比较（X±SD）HeartWeight（g)BodyWeight(kg)HeartWeight（g)/BodyWeight(kg)StudyGroupControlGroupABDK+NOMDACSODControlGroupControlGroupControlGroupControlGroupStudyGroupStudyGroupStudyGroupStudyGroup实验组对照组大鼠血清生化指标(n=6)(n=6)附录：辅酶Q10的国内外研究现状辅酶Q(CoQ)，2,3-二甲氧-5-甲基-6-多异戊二烯-苯醌(2,3-dimethoxy-5-methyl-6-multiprenyl-benzoquinone)。CoQ不但存在于线粒体，还存在于浆膜和微粒体、溶酶体、高尔基体中。CoQ在细胞的生命过程中具有多方面的功能，在细胞中大都以还原型存在。辅酶Q有许多亚型，人体中的存在的亚型称为辅酶Q10，（2,3-二甲氧-5-甲基-6-癸异戊烯-1,4-苯醌），存在于日常饮食中，并可在人体组织细胞中生物合成，是一种氧化还原酶，在电子转移和氧化磷酸化藕联机制中起作用。辅酶Q10浓度的高低，在呼吸链和ATP合成中起了关键作用[1]。上世纪70年代，在日本人就已经发现了辅酶Q10对于高血压有一定的治疗意义。Yamagami等人[2]研究了辅酶Q10对于经去氧皮质酮（deoxycorticosterone）或盐水溶液(saline)诱导的继发性高血压大鼠的作用，发现经过六周的给药后，其对于两者收缩压均有一定的降低作用；但是，不论是对照组、灌注辅酶Q10组还是正常组的外周血管阻力均无显著差异。此后，各国科学家都开始关注于辅酶Q10的降压作用。FolkersK[3]通过研究高血压病人服用辅酶Q10后的各项指标变化，提出辅酶Q10降低血压的机制是由于外周阻力的自我调节（autoregulation），并且认为辅酶Q10本身并无药理活性，而是在转录水平上增长辅酶Q10酶。DanyszA.等人[4]的实验（先给SHR大鼠喂养一定时间的辅酶Q10再注射普通剂量的尼群地平/氨氯地平，分析血压变化）则揭示了辅酶Q10不会增大最大降压幅度，但是能够延长药物对血压控制的时间（延长两倍），因此提出辅酶Q10的使用可以降低其他降压药的使用频率。而RosenfeldtF.[5]也提出将辅酶Q10作为一种治疗高血压的辅助药。在我国，关于辅酶Q10的研究还比较少，但是也已经有人[6]得出了贝那普利（血管紧张素转换酶抑制剂）联用辅酶Q10治疗原发性高血压比单用贝那普利效果好的结论。另外，纵观其他的文献，还能得出以下结论：①Q10对正常大鼠没有降压作用。②在不同的高血压动物模型中，口服辅酶Q10对抑制血压升高或降低血压有效，但即便服用Q10，血压仍比同类正常动物高20到30mmHg。③Q10的降压作用表现在长期反复服药之后，在急性实验中即使用量高达100mg/kg单剂量服用后也无效果。④SHR大鼠模型中，服用（10mg/kg）Q10对收缩压180mmHg的大鼠无降压作用，但对血压更高的大鼠有明显作用。⑤300mg辅酶Q10的摄入量对人体无毒性作用。此外，CoQ10有抗脂质过氧化的作用，能对细胞产生保护作用[7]。其可能的机制为[8]：（1）CoQH2与ADP-perferrylion作用ADP-Fe3+O2-●+CoQH2→ADP-Fe2++H2O2+CoQ(2)CoQH2直接清除O2-●2O2-●+CoQH2→H2O2+O2+CoQ(3)CoQH2脂自由基或脂过氧基反应2L●+CoQH2→2LH+CoQ2LOO●+CoQH2→2LOOH+CoQ氧自由基能攻击生物膜磷脂中的多不饱和脂肪酸(PUFA)引发脂质过氧化作用，并形成脂质过氧化物（LPO），继而分解成一系列复杂产物，其中包括丙二醛(MDA)。脂质过氧化作用及其产物能够对细胞产生损害。而超氧化物歧化酶（SOD）是清除自由基的酶。研究表明[9]，氧自由基损害内皮细胞后，会导致内皮细胞功能受损，表现为血管舒张因子（一氧化氮）分泌的减少。也有证据表明超氧阴离子使NO失活有关，既氧化作用加强导致NO损伤，氧自由基是NO损伤的诱导剂，超氧阴离子及氧化型LDL使内源性舒张因子NO失活，而使内皮细胞受损[10]。以上两者相互作用，使NO含量减少，收缩因子-舒张因子的平衡被打破，血管在收缩因子的作用下发生收缩，使外周阻力升高，诱发高血压[9]。辅酶Q10作为一种抗氧化剂，能够对内皮细胞进行保护，其降低血压的机制可能就与此有关。本实验目的即是想就此进行探讨。参考文献：[1]ErnsterL.FactsandideasaboutthefunctionofcoenzymeQ10inmitochondria.In:FilkersK,YamamuraY,eds.BiomedicalandClinicalAspectsofDcoenzymeQ.VollElseviet/North-Holland.Amsterdam,1997,128[2]YamagamiT.IwamotoY.FolkersK.BlomqvistCG.ReductionbycoenzymeQ10ofhypertensioninducedbydeoxycorticosteroneandsalineinrats.InternationalJournalforVitamin&NutritionResearch.44(4):487-96,1974.[3]FolkersK.DrzewoskiJ.RichardsonPC.EllisJ.ShizukuishiS.BakerL.Bioenergeticsinclinicalmedicine.XVI.ReductionofhypertensioninpatientsbytherapywithcoenzymeQ10.ResearchCommunicationsinChemicalPathology&Pharmacology.31(1):129-40,1981Jan.[4]DanyszA.OledzkaK.Bukowska-KiliszekM.InfluenceofcoenzymeQ-10onthehypotensiveeffectsofenalaprilandnitrendipineinspontaneouslyhypertensiverats.PolishJournalofPharmacology.46(5):457-61,1994Sep-Oct.[5]RosenfeldtF.HiltonD.PepeS.KrumH.SystematicreviewofeffectofcoenzymeQ10inphysicalexercise,hypertensionandheartfailure.[Review][29refs]Biofactors.18(1-4):91-100,2003.[6]杨寿新.贝那普利联用辅酶Q10对原发性高血压疗效观察.中华使用医学杂志.2003,3(4).314-315[7]BeyerRE.FreeRadicBiolMed1990;8:545[8]陈瑷,周玫.自由基医学基础与病理生理.人民卫生出版社.2002;7:141-142[9]赵光胜.抗高血压治疗的新观念----内皮-一氧化氮-氧化应力链.中华医学杂志,2003,83(7),532-533[10]WANGHD,PAGANOPJ,DUY,etal.Superoxideanionfro