浅议有关物质分析方法验证的接受标准

浅议有关物质分析方法验证的接受标准李正邦(杭州民生药物研究院有限公司，杭州311121)摘要目的：阐述HPLC有关物质分析方法各验证项目的接受标准。方法与结果：介绍HPLC有关物质分析方法各验证项目的目的和操作，参阅文献并结合实际工作经验，通过对比分析提出其接受标准。结论：正确理解有关物质分析方法验证的目的，是制定合理接受标准的基础；规范的方法验证需要一个较为公认的接受标准。关键词：HPLC；有关物质；方法验证；接受标准DiscussiononAcceptanceCriteriaofAnalyticalMethodValidationofRelatedSubstancesLiZhengbang(HangzhouMinshengInstituteforPharmaResearchCo.,Ltd.,Hangzhou311121)AbstractObjective:ToelaboratetheacceptancecriteriaforeachvalidationsubjectofHPLCanalyticalmethodforrelatedsubstances.MethodsandResults:IntroducethepurposeandoperationofmethodvalidationforHPLCrelatedsubstances,combiningliteratureresearchwithactualworkexperience,andproposetheacceptancecriteriabycomparativeanalysis.Conclusion:Formulatingreasonableacceptancecriteriaisbasedonunderstandingcorrectlythepurposeofmethodvalidationofrelatedsubstances.Itisnecessarytoestablishmorerecognizedacceptancecriteriaforstandardizingmethodvalidation.Keywords:HPLC;relatedsubstances;methodvalidation;acceptancecriteria有关物质主要是指药品在生产过程中带入的起始原料、中间体、反应副产物，以及贮藏过程中的生成降解产物等。有关物质含量的高低直接反映了药品纯度，基于安全性和质量可控性两方面考虑，对杂质含量应严格控制。因此，对有关物质进行规范地研究，并将其控制在一个安全、合理的限度范围之内，是药品质量研究的重要内容。在质量研究过程中，需要对所涉及的分析方法进行验证，以保证所采用的方法适用于该产品的质量控制。方法验证本身是一个复杂的系统过程，如何评价方法验证的合理性，不仅要设置合理的验证项目，并明确其目的，而且各个验证项目还需要有合理的接受标准。从目前国内外相关的药政法规和文献来看，大多数仅强调概念，无相应的接受标准，有的即使有也不清晰不完整，亦或是10年前的接受标准[1]。近年来对药品质量和审评的要求在不断提高，研发新技术也层出不穷，现有的接受标准，已经难以满足目前对药品质量控制方法的要求，故其也难以评定验证结果是否符合要求，这在业内也引起了不小的困惑。鉴于此，本文以HPLC有关物质分析方法验证为例，结合相关文献和实际工作经验，抛砖引玉，对有关物质方法验证的接受标准进行分析探讨。1系统适用性系统适用性是对测试程序和参数进行确证，以保证系统能在使用时作为一个整体正确运行。对于HPLC的适用性包括理论板数、分离度、灵敏度、拖尾因子和重复性等五个参数，要求用规定的对照品溶液或系统适用性溶液在规定的色谱系统中进行试验，必要时，可对色谱系统进行适当调整，以符合要求[2]。1.1分离度测试用于评价待测物质与被分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统分离效能的关键指标。试验前色谱系统要充分平衡，然后分别取空白溶液、分离度溶液注入色谱仪。分离度溶液要根据产品的情况来配制，选择与主成分结构相近，并且最能表达本系统的分离情况的相关物质或降解产物，与主成分配制在同一个量瓶中。计算分离度、拖尾因子和理论板数。1.2灵敏度测试用于评价色谱系统检测微量物质的能力，可采用直观法、信噪比（S/N)法，或者根据响应值的标准偏差和斜率（σ/S）[2-3]来表示。一般多采用信噪比法，通过测定一系列不同浓度的供试品或对照品溶液来测定信噪比。1.3重复性是考察HPLC响应值的重复性能的指标，也称为进样精密度。连续进对照品溶液五针，计算峰面积相对标准偏差（RSD），若RSD大于2.0%则对照品溶液连续进六针，采用自身对照法检测有关物质，取第一份供试品的对照溶液作为进样精密度试验溶液。1.4接受标准一般均要求分离度不小于1.5；理论板数主要由色谱柱的填料及规格、流动相、流速和被测物质等因素决定，无明确要求，这应该根据具体情况来制订；拖尾因子在《美国药典》（USP）和《欧洲药典》（EP）中称为对称因子，有多种计算方法，在《中国药典》、USP和EP中的计算公式均为：T=W0.05h2d1[2-4]式中T为拖尾因子；W0.05h为5%峰高处的峰宽；d1为峰顶在5%峰高处横坐标平行线的投影点至峰前沿与此平行线交点的距离。当T大于1.05时表现为拖尾峰，T小于0.95时表现为前沿峰，《中国药典》要求为0.95~1.05。根据实际经验来看，这个标准一般较难达到；查阅2015年版《中国药典》各论，发现在0.8~5.0的较大范围均有相关品种，多数为2.0；USP39各论在0.5~4.0，多数在1.5~2.0之间；在EP8.0中要求，在定量测定时对称因子应在0.8~1.5；在CDE（国家药品审评中心）审评原则中也将其设定为不大于2.0。考虑到色谱峰的实际情况建议拖尾因子应为0.8~1.5。药品中杂质水平多在0.5%以下，《中国药典》中要求重复性峰面积的RSD不大于10%；CDE审评原则中要求订为2.0%，对于其保留时间也有要求，RSD不大于1.0%。因此，系统适用性的接受标准可归纳为：①除另有规定外，要求分离度不小于1.5，理论板数应符合规定，拖尾因子应为0.8~1.5；②灵敏度在定量测定时S/N或者σ/S不小于10，定性测定时S/N或者σ/S不小于3[2,5]；③对照品溶液峰面积RSD不大于5.0%，保留时间RSD不大于1.0%。2专属性专属性是指在其他成分可能共存的情况下，分析方法能正确测定被测成分的能力，是分析时受到相互干扰程度的度量，又称之为选择性[6]。专属性好则说明其他组分对待测物的测定无干扰或者干扰在可接受的范围内，同时也证明该方法是具有稳定性指示性的测定方法；当一种方法缺乏专属性时，应采用其他辅助的分析方法予以补充。一般通过基质干扰和降解试验来考察方法的专属性。要求采用二极管阵列或质谱检测器来监测[57]，在实际工作中多采用DAD检测器，要求列出各项试验的UV光谱、3D图、等吸收图和色谱峰的纯度。2.1基质干扰2.1.1样品基质干扰包括稀释剂和辅料等干扰。根据供试品溶液的配制方法，分别配制一倍量的辅料浓度和三倍量的辅料浓度的溶液用于限度研究。2.1.2已知杂质干扰根据已知杂质的限度，配制限度浓度的杂质对照品溶液，并利用杂质和供试品配制混合溶液，该溶液中杂质的浓度相当于限度浓度，分别进杂质对照品溶液、供试品溶液和混合溶液。2.2降解试验主要将供试品在酸、碱、氧化、光照、干热、湿热等条件下进行适当的降解，通过分离各降解杂质来挑战拟定分析方法。降解试验的供试品溶液要按照有关物质分析方法中的要求来配制，同时进行相关的对照研究，包括空白试剂、空白辅料、阴性对照等。2.3参数记录记录各相邻色谱峰的分离度，主成分及已知杂质的峰纯度，并查看3D图、等吸收图，检查有无杂质在所采用的检测波长下漏检，考察该分析方法的波长选择是否合适，如有必要，应采用质谱检测器对降解的供试品溶液等进行进一步分析。2.4接受标准2.4.1干扰要求空白对照无干扰[1]，实际上很难做得到，笔者认为应根据不同的质控要求来设定，如：一倍量辅料的溶液对各杂质定量测定无干扰，稀释剂、三倍量辅料的溶液等对各杂质限度测定无干扰。2.4.2降解强度RagineMaheswaran对于降解强度推荐的是5%~20%[8]，霍秀敏推荐为20%～30%[9]，药典委建议的是5%~10%[10]为宜，CDE认为降解在10%左右较为合适[11]。药品在实际生产、储存和使用过程中，达到10%以上的降解是几乎不会发生的，若如此过度降解很可能已经发生了二次降解，同时容易造成质量不平衡[11]，过度的降解不仅增加了方法开发的难度，而且实际意义也不大，因此建议各降解条件下以主成分降解约在5%~10%为宜，但是对于降解条件变得较为强烈，产品仍未降解的，则不必强求。2.4.3峰纯度峰纯度主要考察是否有其他杂质包含在被分析色谱峰中而未被检出，纯度高不表示不含有其他杂质[10,12]，故该参数有一定的局限性，必要时采用其他检测手段进行检查。对于主成分、已知杂质、主要降解杂质的峰纯度因子不小于990，或者纯度角不小于纯度阈值。2.4.4分离度杂质峰与其他峰的分离度不小于2.0[1]，在实际工作中，发现敏感降解条件下即使主成分仅降解5%，这个要求就很难达到。笔者认为应根据杂质的性质和限度水平分类要求，且仅考察报告限度以上的杂质，参考系统适用性的要求，认为与主峰最近的色谱峰的分离度不小于1.5，与已知杂质峰最近的色谱峰的分离度不小于1.0，即达到挑战方法的目的，又不影响杂质的定量测定。2.4.5质量平衡质量平衡多要求在初始值±10%以内[10-11]，考虑到降解强度在5%~10%，因此，认为其在初始值±5%内更为合理。3溶液稳定性溶液稳定是保证各项试验真实、准确的前提和基础，如发现溶液不稳定，应在分析方法中明确提示，同时要求各项试验必须在溶液稳定的时间范围内完成。在《中国药典》2015年版通则（9101）和USP39版1225中，均将溶液稳定性试验归在耐用性项下，但是从该研究的性质和重要性来看，是耐用性的其他参数不可相提并论的，因此，溶液稳定性试验应单独作为一个验证项目来考察。一般对照品溶液和供试品溶液都需要进行考察，考察多长时间，应根据具体品种而定，但是要同时考虑到该产品实际检测时最长耗时以及溶液何时出现不稳定点这两个因素。对于溶液稳定性小于4h的产品，需要在方法中注明临用新配并立即进样，不到2h的应考虑改换溶剂、改变放置条件或改用其他测定方法。3.1起始物料和中间体可以采用对照品溶液和（或）供试品溶液连续进样，在溶液稳定的前提下至少考察12h。3.2成品包括原料药和制剂，应每天新配对照品溶液，测定按照规定条件放置的对照品溶液和供试品溶液，至少测定3d；如果溶液不稳定，可采用连续进样的方式进行测定，检测时间点宜先密后疏，如0、1、2、3、4、6、8、10、12、16、20、24、32、40、48h。计算放置后的对照品溶液的含量和供试品溶液中杂质的含量，并与初始点的含量相比较。3.3放置条件首先考虑在室温条件下（25℃）进行，如果溶液不稳定，再考虑在冷藏条件下（2~8℃）进行。对于创新药一般两种温度条件都要考虑，对光敏感的产品，还应该考察是否避光对溶液稳定性的影响。3.4接受标准3.4.1对照品含量与初始值相差5%即为显著变化[13]，若放置后对照品溶液的含量是初始结果的95%~105%，则认为对照品溶液是稳定的。3.4.2供试品对于供试品中的杂质，根据主峰面积的RSD是否小于2.0%来判断显然是不足的，谢沐风也指出了其中的不足，并提出通过峰面积归一化法来判定[14]。这种方法诚然不错，但是对于不同限度水平的杂质是否都用2.0%来判定，文中并未提及；杂质含量的绝对值在±0.1%以内，新杂质不大于报告限度[1]，结合《中国药典》2015年版通则（9101）精密度和ICHQ3A(R2)[16]对不同水平的杂质应分级考察的指导思想，拟提出若杂质含量（X）与初始含量的差值符合下列标准，