第八章色谱分离技术

第八章色谱分离技术第一节色谱分离技术概要色谱技术的起源:叶绿素的石油醚溶液通过碳酸钙管柱,并继续以石油醚淋洗,由于碳酸钙对叶绿素中各种色素的吸附能力不同,色素被逐渐分离,在管柱中出现了不同颜色的谱带。色谱系统由固相定相、流动相、泵系统和在线检测系统组成。特点是分离效率高，能分离性质极性类似的物质，能用于少量物质的分析鉴定，也可用于大量物质的分离纯化制备。一、色谱技术的基本概念利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性、分子大小、带电情况、离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异，使其在流动相与固定相之间的分配系数不同，达到彼此分离的目的。图例P175加入洗脱剂使各组分分层的操作称为展开。洗脱时从柱中流出的液体称为洗脱液。展开后各组分的分布情况称为色谱图。将样品加到柱上的操作称为上样或加样。（一）固定相可以是固体物质，也可以是液体物质组成：空间结构部分，决定固定相尺寸与孔隙率；化学和生物大分子功能性成分，决定介质与目标溶质特异性相互作用的能力。（二）流动相推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界流体。柱色谱中称为洗脱剂，薄层色谱中称为展开剂。（三）分配系数定义：在一定条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值。它是色谱中分离纯化物质的主要依据。待测组分在固定相和流动相之间发生的吸附，脱附或溶解，挥发的过程叫做分配过程。msddCCKK的依据）（分配系数是色谱分析组分在流动相中浓度组分在固定相中的浓度不同物质的分配系数不同，分配系数的差异程度是决定几种物质采用色谱方法能否分离的先决条件。差异越大，分离效果越理相。（四）阻滞因素阻滞因素又称迁移率，指在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。相对迁移率：指在一定条件下，在相同时间内，某一组分在固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。（五）分辨率分辨率也称分离度，一般指相邻两峰分开程度。用Rs表示，Rs越大，两组分分离得越好。当Rs=1时，两组分具有较好的分离，分离纯度为98%。当Rs=1.5时，两组分基本完全分开，每种组分纯可达99.8%。（六）解离常数Kp和分离因素(P178图8-10)用解离常数讨论分子间的相互作用。分离因素定义为某一瞬间被吸附的溶质占总量的分数。对于一个有效的柱色谱分离，通常要求≥0.8，Kp一般要求≤0.1mol/l。（七）色带变形和“拖尾”现象原因：固定相在色谱柱中横向填充的不均匀，在固定相颗粒粗的地方，溶剂和溶质流速快，就会形成斜歪、不规则的色带；由于平衡关系偏离线性所引起的，当柱中目标物质的色带移动时，分子由于纵向扩散或不均匀流动超出了色带前缘，相对于后面的主色带被阻滞，结果在主色带前缘产生一个自动削尖效应。方法：使用细长的色谱柱；使用不同梯度的缓冲液；选择合适的展层剂。（八）正相色谱与反相色谱正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性。非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动速度快，先从柱中流出来。反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种色谱过程中，极性大的分子比极性小的分子移动速度快而先从柱中流出。分离纯化极性大的分子，采用正相色谱；分离纯化极性小的有机分子，采用反相色谱。（九）操作容量操作容量是指在一定条件下，某种组分与固定相反应达到平衡时，存在于固定相上的饱和容量。数值越大，固定相对该物质的亲和力越强。（十）洗脱体积使溶质从柱中流出时所通过的流动相的体积，称为洗脱体积。不同的溶质有不同的洗脱体积（十一）色谱法的塔板理论可以给出在不同瞬间，溶质在柱中的分布和各组分的分离程度与柱高之间的关系。要点：柱子可以分成多层，每一层为一理论塔板，且有一定高度；在色谱柱中，物质只有横向扩散，无纵向扩散，两相瞬间达到分配平衡；体系中其他物质的存在不影响待分离物质的分配。（十二）检测方法吸光度、化学发光、电化学、电导率、荧光、红外吸收光谱、折射率、质谱等。二、色谱法的分类（一）根据固定相基质的形式纸色谱：以滤纸作为基质薄层色谱：将基质在玻璃或塑料等光滑表面铺成一薄层，在薄层上进行色谱过程。柱色谱：将基质填装在管中形成柱形，在柱中进行色谱分离。（二）根据两相所处的状态流动相为气体的称为气相色谱流动相为液体的称为液相色谱（三）根据分离原理的不同吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等。1、吸附色谱以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离的目的。2、分配色谱在一个有两相同时存在的溶剂系统中，不同物质的分配系数不同而达到分离的目的。相当于连续性的溶剂抽提方法。3、离子交换色谱以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而进行分离的技术。固定相为离子交换剂，流动相为电解质溶液。4、凝胶过滤色谱以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分子大小进行分离的技术。分子筛原理。小分子物质易进入凝胶颗粒内部，流出柱子时间长，大分子不易进入凝胶内部，先流出色谱柱。5、亲和色谱根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力，将某种配体连接在载体上作为固定相，而对能与配体特异性结合的生物大分子进行分离的一种技术。亲和色谱是分离生物大分子最为有效的色谱技术。三、色谱系统的操作方法（一）装柱P183装柱是成功得到分离物质最关键的一步。一般实验室采用重力沉降法和加压法进行装柱。（二）平衡色谱柱填装好后，必须用起始缓冲液平衡到与之pH和离子强度相同时才可使用。装好的柱子要求均匀，无纹路，无气泡，柱顶部平整。用蓝色葡聚糖-2000在恒压下走柱，若色带均匀下降，则柱填装均匀。（三）上样量和上样体积上样体积越小，量越少，分离效果越好。对于分析型色谱，加样量一般不超过柱床体积的0.5%-1%，制备型色谱加样量一般不超过柱床体积的1%-3%。分子筛加样量要远小于离子交换色谱。（四）洗脱改变洗脱液的pH,使大分子的电荷减少，从被吸附状态变为解离状态。改变离子强度，增加洗脱液的离子强度，将被分离物从交换剂上换下来。同时改变pH及离子强度。洗脱方式有三种：一步洗脱、阶段洗脱、梯度洗脱梯度洗脱洗脱液中含有两种或以上不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变洗脱液中溶剂的配比和极性，通过洗脱液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果。它可使分离时间缩短，分辨能力增加，提高最小检出量和精度。与气相色谱是的程序升温作用相似。（五）流速及控制洗脱液的流速会影响色谱的分辨率，在整个分离过程中，要保持一个稳定的流速。此流速要经过反复实验来确定。流速过高，使色谱峰加宽，降低分辨率。流速可通过调节操作压力来调节。（六）分部收集要将各组分分离，必须将溶液在洗脱液中已经分离的各组分分部收集。每管收集的体积越小，越容易得到纯的组分。分部收集可以人工操作，也可通过自动部分收集器实现。（七）检测和合并收集洗脱液按一定体积分别收集于试管中，为测定各部分中各种成分的分布，要用能特异性检测被分离化合物的方法来进行分析。比如吸光度。洗脱液的合并：根据洗脱峰的位置合并较窄的部分，纯度较高；合并较宽的部分，含量较多。（八）洗脱峰纯度鉴定检测系统分辨率有限，一个对称洗脱峰不一定代表一个纯净的组分。可进一步采用电泳法、高效液相色谱法进行鉴定。（九）脱盐和浓缩纯度检测完毕后，可将同一组分合并。但要得到产品，必须进行浓缩。可采用超滤法、透析法、冷冻干燥法或盐析、有机溶剂沉淀法。科研用的高纯度样品，需将已浓缩的样品再一次上柱检测。第二节吸附色谱法一、吸附色谱基本原理固体物质具有吸附性能力，可将物质从溶液中吸附到它的表面上。吸附剂从溶液中吸附物质的同时，也有部分被吸附的该物质从吸附剂上脱离（解吸）。被解吸下来的物质向前移动时，遇到前面新的吸附剂会被重新吸附，然后又被后来的洗脱液再次解吸，继续向前移动。经这样反复地吸附-解吸-再吸附-再解吸的过程。物质沿洗脱液的前进方向移动，移动速度取决于吸附剂对该物质的吸附能力。吸附能力强，则向前移动速度慢，反之则快，不同组分便会逐渐分离开。二、吸附薄层色谱法将吸附剂均匀地铺在一块玻璃上，形成薄薄的平面涂层，干燥后在涂层的一端点样，竖直放入一个盛有少量展开剂的有盖容器中，展开剂接触到吸附剂涂层，借毛细作用向上移动形成薄层色谱，使混合物得以分离。（一）基本原理吸附剂对样品中各成分吸附能力不同，以及展开剂对它们的解吸附能力的不同，使各成分达到分离。经过在吸附剂与展开剂之间多次吸附-溶解作用，将混合物中各组分分离成孤立的样点，实现混合物分离。（二）吸附薄层色谱条件1、固定相选择常用吸附剂（固定相）有硅胶、氧化铝和聚酰胺等。固定相颗粒的大小对展开速度、迁移率、分离效果有显著影响。2、展开剂选择主要根据样品中各组分的极性、溶剂对于样品中各组分溶解度等因素来考虑。先用一种极性较小的溶剂为基础，若展开不好，则用极性较大的溶剂与前一溶剂混合，调整极性，再次实验，直到先出适合的展开剂。3、相对移动值从点样开始到展开后的溶剂前沿。混合物中各组分的移动距离不同。4、显色分离化合物若有颜色，可易识别，无需显色。化合物没有颜色时，要识别点样，使之显色。主要有碘蒸气显色、紫外线显色、喷雾显色。（三）薄层色谱操作1、制板玻璃板洗净，硅胶调成糊，均匀摊在玻璃上，晾干。用前烘干。2、点样微量进样器在距底边1.5-2.0cm处点样，直径小于3mm。3、展开吹干样点，竖直放入层析缸中。展开剂要接触到吸附剂下沿，但不接触样点。盖上盖子，展开。待展开剂上行到一定高度，取出板，画出展开剂前沿线。4、显色、计算迁移率吹干展开剂，合适方法显色，测量移动距离，计算相对移动值。三、吸附柱色谱法（一）基本原理在一定条件下，吸附剂与被分离物质之间产生作用，这种作用主要是物理和化学作用。物理作用来自于分子间的范德华力，化学作用主要是氢键作用。（二）吸附柱色谱条件1、色谱柱选择通常使用玻璃柱，可直接观察色带移动情况。工业大型色谱柱可用金属制造，在柱壁嵌一条有机玻璃带。2、吸附剂的选择所选吸附剂应有最大的比表面积和足够的吸附能力，对欲分离的不同物质应有不同的溶解和解吸能力。与洗脱剂、溶剂及样品组分不发生化学变化颗粒均匀，操作过程中不破裂。3、洗脱剂的选择洗脱剂纯度较高，不与样品和吸附剂起化学反应。对样品溶解度大，黏度小，易流动，容易与洗脱剂组分分开。（三）吸附色谱应用主要体现在对生物小分子物质的分离，在生物化学和药学领域有比较广泛的应用。第三节分配色谱法一、基本原理分配色谱法是利用被分离物质中各成分在两种不相混溶的液体之间分布情况不同而使混合物得到分离。相当于一种连续性的溶剂提取方法。是把其中一种溶剂固定，用另一种溶剂冲洗。这种分离不经过吸附程序，仅由溶剂提取而完成，因此叫分配色谱法。固定在柱内的液体称固定相，需一种固体吸附它，此固体只起支撑作用，而不起分离作用。用作冲洗的液体称流动相。流动相与固定相发生接触，样品中各成分在两相间的分布不同，因此移动速度不同。易溶于流动相的成分移动快，而在固定相中溶解度大的成分移动慢，依此得到分离。二、分配色谱条件1、载体的选择惰性的，没有吸附能力的，能容留较大量固定相的物质。主要有硅胶、硅藻土、纤维素等。2、固定相的选择常用的固定相有水、缓冲溶液、酸的水溶液、甲酚胺、丙二醇、有机溶剂等。3、流动相选择一般选用为水所饱和的有机溶剂或水-有机溶剂互溶的混合液。如石油醚、醇类、酮类、苯类等。三、分配色谱基本操作1、装柱固定相与载体混合后装柱。2、加样被分离物配成浓溶液，加到固定相载体上端；被分离物溶液用含固定相载体吸收，溶剂挥发后，加在载体上端；滤纸吸附被分离物，溶剂挥发后，放在载体上。3、洗脱四、分配色谱法应用适用于分离极性大，在有机溶剂中溶解度小的成分，或极性很相似的成分。第四节离子交换色谱法一、基本原理通过分子中的活性离子将溶液中带相反电荷的物质吸附在离子交换剂上，然