项目4生化技术生产生物药物

项目4：生化技术生产生物药物任务1：生化提取法生产木瓜蛋白酶教学安排：1.员工培训由老师讲解木瓜蛋白酶生产的理论基础及应用范围。分配实操任务：木瓜蛋白酶的生产。2.学生模拟组建运营一个木瓜蛋白酶生产企业，撰写计划书(在理论教学期间完成)。市场部：木瓜蛋白酶的结构、功能、用途，木瓜蛋白酶市场状况与销售预测，原料来源状况，竞争对手状况与分析。技术部：确定木瓜蛋白酶生产的工艺流程及工艺参数，编制生产操作规程，确定生产车间的布局。品控部：制定木瓜蛋白酶的质量标准，生产取样分析操作规程，质量检测标准和操作规程。总经理：协调监督各部工作，最后拿出完整的计划书。3.计划书实施。计划书要先经过老师的审核，然后实施。实施过程中考核操作技能。实施后及时进行实训报告的撰写也总结。•第一节生化提取技术基础•一药用酶的生产来源•（一）药用酶的来源•动植物提取法；•微生物发酵法。•（二）生化制备法•1原料选择应注意的问题•（1）酶在生物材料中的分布；•（2）考虑生物的发育阶段及营养状况；•（3）动物组织宰杀后立即取材；•（4）生化制备的综合成本。•2生物材料的预处理•（1）机械处理•（2）反复冻融处理•（3）制备丙酮粉•（4）微生物细胞的预处理•3酶的提取•（1）水溶液法•应考虑的因素：①酶稳定性；②酶的溶解度；③酶与其它物质结合的性质；•（2）有机溶剂法；•（3）表面活性剂法。•4酶的纯化•（1）杂质的去除•杂质：杂蛋白、多糖、脂类和核酸。•①调pH和加热沉淀法；•②蛋白质表面变性法；•③选择性变性法；•④降解或沉淀核酸法；•⑤利用结合底物保护法除去杂蛋白。•（2）脱盐•①透析•②离子交换法；•（3）浓缩•①冷冻干燥法；•②离子交换法；•③超滤法；•④凝胶吸水法；•（4）酶的结晶•①酶的结晶方法•a盐析法；•b有机溶剂沉淀法；•c复合结晶法；•d透析平衡法；•e等电点法。•②结晶条件的选择•a酶液的纯度越纯越容易形成结晶；有纯化作用；•b酶的浓度浓度越高越容易结晶；•c温度低温有利；•d时间好的结晶是在生长慢的条件下形成的；•epH值选择等电点附近；•f金属离子许多金属离子有促进作用；•g晶种•h结晶器皿处理充分清洗、烘干。•（5）酶分离和纯化过程应注意的问题•①防止酶蛋白变性避免高温，避免pH值过•高或过低，避免剧烈搅拌，避免与重金属接触。•②防止辅助因子流失•③防止酶被蛋白水解酶降解；（三）微生物发酵法•1高产菌株的选育；•2发酵工艺的优化；•3培养方法；•4影响酶产量的因素；•（1）温度；•（2）pH值；•（3）通气和搅拌；•（4）泡沫和消泡剂；•（5）添加诱导剂和抑制剂。•第二节木瓜蛋白酶生产技术•一、结构与性质•木瓜蛋白酶为白色、淡褐色无定形粉末或颗粒。略溶于水、甘油，不溶于乙醚、乙醇和氯仿。最适温度65℃，易变性失活；木瓜蛋白酶等电点pI=9.6。半胱氨酸、硫化物、亚硫酸盐和EDTA是木瓜蛋白酶激活剂，巯基试剂和过氧化氢是木瓜蛋白酶的抑制剂。•木瓜蛋白酶是单条肽链，有211个氨基残基组成，相对分子质量为23000。•二、生产工艺•1、原料采集•用锋利刀片在未成热的青果表面纵割若干条线，深度也应在2mm深以内，环绕茎干装一倒伞形收集盘，接收流下的乳汁。•每个果一次割3条线，4天割一次，每次采割时间在清晨或中午下雨后。选择2.5～3月龄已充分长大的青果采割产量最高。割后30～60s乳汁停止流出，把粘在果上的乳汁赶入收集盘混合收集。用浸过硫酸钙或杀菌剂溶液的洁净布擦净，防切口感染。•2粗制提取工艺干燥粗制木瓜乳汁滤渣(弃去)滤液粗品•(1)粗制不锈钢锅中，在搅拌的条件下加入含0.1％四乙酸乙二胺化二钠和0.3％氯化钠溶液，并加入还原剂0.06mmol／L硫代硫酸钠和0.08mmol／L半胱氨酸的混合液，混匀后过滤，收集滤液。•(2)干燥将滤液置于干燥机中干燥，即得粗品。•3、精制工艺盐析，过滤精制木瓜蛋白酶粗品不溶物除去滤液木瓜蛋白酶结晶•(1)粗制•将木瓜乳汁倾入搪瓷缸中，在搅拌的条件下加入硫酸铵使其达到45％饱和度时，木瓜蛋白酶即沉淀，然后静置过夜，离心，收集沉淀，得木瓜蛋白酶粗品，木瓜凝乳酶在上清液中。一步将两个酶分离。•(2)精制•沉淀置于搪瓷缸中，搅拌下加入1倍体积的0.1％四乙酸L二胺化二钠和0.3％氯化钠溶液，并加入还原剂0.06mmol／L硫代硫酸钠和O.08mmol／L半胱氨酸的混合液，然后用0.1mol／L氢氧化钠或0.1mol／L，盐酸pH至9.0，搅匀溶解，离心或过滤除不溶物。清液取1OOmL作硫酸铵盐析曲线，得出盐析范围，先向溶液中加硫酸铵至盐析曲线的下限，拌匀，离心除不溶物，清液中补加硫酸铵至上限，静置，析出结晶，为木瓜蛋白酶结晶。•(3)盐析•先向溶液中加硫酸铵至盐析曲线的下限，拌匀，离心除不溶物，清液中补加硫酸铵至上限，静置，析出结晶，为木瓜蛋白酶结晶•参考工艺：木瓜乳汁提取不溶物除去木瓜蛋白酶滤液沉淀上清液（弃去）木瓜酶沉淀精制上清液（弃去）沉淀产品干燥•作业：•1、酶提取的注意事项有哪些？•2、木瓜蛋白酶的有哪些用途？•3、如何收集木瓜乳？•4、如何精制木瓜蛋白酶？