提植物总RNA及去DNA和反转录标准方法(会给实验室一大笔提取试剂盒的经费)

Trizol法提取植物总的RNA及反转录可用于RT-PCR【中文版】一、植物总RNA的提取抽提RNA所用的研钵酒精灼烧5-10min或灭菌.，器皿均高温高压灭菌，以去除RNA酶，所有试剂都保证没有RNA酶污染。1)1.5ml离心管,取0.1g组织在液氮中研磨至粉末,立即加入1mlTrizol，涡旋充分混匀后放置2min。2)加0.2体积（氯仿Chloroform），剧烈振荡15s（vortex），室温放置3min（或不放置，直接离心）。3)4℃，12000rpm离心5min，样品会分成3层，取上层水相，取上清。4)加等体积的异丙醇，混匀，4℃放置10min以上。或可以-80℃过夜。5)4℃，12000rpm离心20min，4℃弃上清，管底管侧形成胶状沉淀（可看到白色沉淀）。6)加1ml75%乙醇，充分溶解沉淀。4℃，12000rpm离心5min。倒掉上清，用移液器吸干。7)晾干约10min。(不要晾太长时间，看不到水就可以加灭菌水)8)加50μl灭菌的超纯水，65℃溶解，-20℃（最好-80℃）保存。（注：要是处理DNase就不能加这么多水。可以加5μl）整个提取步骤最好咋在4℃或冰上完成二、DNaseI处理消化植物总RNA中的基因组DNA1)将上述全部提取的植物总RNA5μl，然后顺序加入1μl10×缓冲液，1μlDNase，3μlRNase-free水，总体积10μl，充分混匀后，37℃温育30min。2）加入300ul灭菌水提高体积，然后加入300ulPCI，vortex；4℃，12000rpm离心5min；3)加入1/10体积3M醋酸钠(autoclaved)pH5.2,和2倍体积的100%EtOH；（-20℃，10-30min或可以-80℃过夜）4)4℃，12000rpm离心15min，6)75%EtOH,300ul,12000rpm5min7)dry（10-15min）andadd30-50ulofddH2O三、反转录cDNA1)在上述总体积为11μl反应液中加入1μlOligo(dT)18引物4μl5×缓冲液，2μldNTP，1μl反转录酶，1μlRNase抑制剂，总体积20μl，充分混匀后，42℃温育1-1.5hr。2)70℃温育10min，终止反应RNAextractionfromplantsusingTRIZOLandreversetranscription【Englishvision】RNAextractionfromplants：1.Prepare1.5mlSafe-lockEppendorftubesandadd0.1gtissueofplant,grindinliquidnitrogen,Immediatelyadd1mlofTRIZOLtothehomogenizedtissueatRTfor2min.2.Add0.2mlofchloroformper1mlTRIZOL10.Shakevigorouslybyhandfor15seconds.11.IncubateatRTfor3min.12.Centrifugethesamplesat13000rpmfor15minat4°Cforphaseseparation.13.Transfertheaqueousupperphasetonewtubes(ca50-60%ofTRIZOLvol.)14.PrecipitateRNAbymixingwith0.5mlisopropanolper1mlTRIZOL15.IncubateatRTfor10minutes16.Centrifugethesamplesat13000rpmfor10minat4°CtoobtainpelletsRNAwash:17.Removesupernatantandwashpelletswith1ml75%EtOH(dilutedwithDEPCtreatedwater).18.Vortexonceandcentrifugeat7500xgfor5minat4°C19.Discardsupernatantanddrypelletsfor5minatRT(orinspeed-vac)20.DissolvepelletsinDEPCtreatedwater21.Incubateat55°Cfor10minutes.Storeat–80°Cuntiluse.3)4degree,12000rpm,5min4)add1/10volumeof3MSodiumacetate(autoclaved)pH5.2,and2volumeof100%EtOH.4)Storeat-80degreeovernightormorelonger.5)12000rpm,4degree,15min6)75%EtOH,300ul,12000rpm5min7)dryandadd30-50ulofddH2O