高青(北京市药品检验所)—残留溶剂GC检查方法的设计与

残留溶剂GC检查方法的设计与验证－毛细管检查方法高青北京市药品检验所一、检测器二、溶媒三、供试品溶液的配制四、顶空瓶中样品体积五、色谱柱六、温度七、进样方式八、提高灵敏度九、提高分离度十、未知峰归属十一、方法验证一、检测器FID（火焰电离）、NPD（热表面电离）和ECD（化学电离），应用范围分别为有机物、氮/磷化合物、电负性物质（卤代烃）。多数情况下，三氯甲烷、DMF、DMSO均用FID检测，但需采取一些措施提高检测灵敏度。四氯化碳则必须用ECD检测器。以下三点注意：FID－质量型检测器，对有机物均有响应，只是对难电离的卤代烃和氮/磷化合物灵敏度比ECD、NPD检测器低很多。ECD－半选择性的检测器，对多种类型化合物均有响应。如果含有其他非卤代烃溶剂，应进行系统适用性试验考察分离度。＊＊如果采用FID检测器，同时又采用填充柱测定三氯甲烷，灵敏度达不到限度要求。＊二、溶媒选择原则：溶解样品，并对色谱柱无损坏例如直接进样不能含GC不能分析的无机盐顶空进样：首选水，其次DMF、DMSO、不挥发酸碱溶液，不可使用盐酸溶液和氨水，可选择在80～90°C加热能溶解样品的试剂。温度太高爆瓶如待查成分为苯、甲苯、三氯甲烷等水溶性不好的溶剂，可采用混合液，即先用少量乙醇或甲醇溶解待查溶剂再用水稀释。当待测溶剂在有机相中的分配系数明显大于水相（例如三氯甲烷），对顶空进样来说采用有机相如DMF为溶剂不是很好的选择（K大，灵敏度低）；如果样品也只能在有机相中溶解，建议采用混合液。直接进样：水、合适的有机溶媒或混合液。对于非极性色谱柱，水对柱有影响，会缩短柱的使用寿命。助溶方式：有报道加5%SDS助溶。顶空小平加盖后可超声加热助溶三、供试品溶液的配制不可超声或加热助溶＊，以免残留溶剂挥发；如果顶空进样，样品置顶空瓶封盖之后可以超声或加热溶解。大颗粒样品不可以研磨取样，只能取原态样品（或冷冻粉碎）。顶空进样方式要求对照品配制与供试品配制方法应绝对一致，否则顶空瓶中气液平衡状态有差异（基质效应）。对照品配制最好采用标准加入法。四、顶空瓶中样品体积顶空样品瓶中的样品体积（Vs）对分析结果影响很大，因为它直接决定了相比β。Cg＝Co/（K＋β）其中β＝Vg/Vs，K＝Cs/Cg，当Kβ时，样品体积改变对灵敏度影响很小。当Kβ时，影响很大。例如，分析水中的二氧六环和环己烷（三氯甲烷），60ºC平衡，两者的K分别为642、0.04。当样品体积由1ml增加至5ml，二氧六环的峰面积只提高了1.3％，而环己烷却提高了452％。根据实际经验来说，20ml顶空瓶样品装量为5ml比较适当。五、色谱柱残留溶剂检查大多需要较高的分离度和检测灵敏度，通常采用毛细管色谱柱。填充柱口径大，造成溶剂峰扩散，检测灵敏度低＊。实践证明，使用非极性至中等极性色谱柱，配合适当柱温梯度可分离大部分有机溶剂。通常当待查溶剂数目仅两、三种时，可用极性较强的色谱柱，出峰快，分析时间短；当溶剂数目较多时，还是优选非极性至中等极性柱分离较好。非极性柱弱极性柱中低极性柱中等极性柱商品名DM-1,DB-1,HP-1,SPB-1,BP-1,SE-30,Rtx-1,ZB-1,AT-1,CP-Sil5CB等DM-5,DB-5,HP-5,SPB-5,BP-5,SE-52,Rtx-5,ZB-5,PE-5,SE-54,CP-Sil8CB等DM-35,DB-35,HP-35,SPB-35,BP-35,Rtx-35,ZB-35,等DM-1701,HP-1701,SPB-7,ZB-1701,Rtx-1701,CP-Sil19CB等化学成分100％二甲基聚硅氧烷5%苯基-甲基聚硅氧烷35%苯基65%甲基聚硅氧烷14%氰苯基86%甲基聚硅氧烷中等/强极性极性柱极性柱商品名DB-225,HP-225,SP-225,BP-225,DB-23，Rtx-225,AT-225,OV－225等DB-WAX,HP-INNOWAX,DB-WAXetr,CP-WAX,ZB-WAXDB-FFAP,HP-FFAP,CP-FFAP，OV-3501等化学成分50％氰丙基甲基聚硅氧烷聚乙二醇（PEG）硝基对苯二酸改性的聚乙二醇六、温度色谱柱：初温应接近样品中最轻组分的沸点，而终温则取决于最重组分的沸点，升温速率则要依样品的复杂程度。进样口：一般接近沸点最高的组分，但要低于易分解组分的分解温度。常用的条件是250ºC。检测器：原则是避免流出色谱柱的组分冷凝。FID检测器通常设置为300ºC。顶空瓶平衡温度：温度越高，蒸汽压越高，顶空气体的浓度越高，分析灵敏度越高。待测组分的沸点越低，对温度越敏感。但温度的改变只影响分配系数K，并不影响相比β。例如水溶液中的甲醇、甲乙酮、甲苯、正己烷和四氯乙烯，80ºC平衡温度与40ºC平衡温度相比，甲醇在顶空气体中的浓度增加5.15倍，甲乙酮浓度增加2.61倍，甲苯只增加25%，而正己烷和四氯乙烯，分别增加2.6%和10.4%。实际工作中往往是在满足灵敏度的条件下，选择较低的平衡温度。过高的温度可能导致某些组分的分解和氧化。一般采用高沸点溶剂时，样品比较稳定的情况下，推荐80ºC左右的平衡温度。七、进样方式作为残留溶剂检查，顶空进样有许多优越性，不需要对样品进行特殊处理，不用担心样品中不挥发组分对GC分析的影响。直接进样对仪器要求低，由于部分实验室不具备顶空进样器，该方法的应用也具普遍性。进样方式选择需注意的几点：对于待测溶剂在溶解样品的溶剂中溶解度小（分配系数小）的情况下，例如三氯甲烷在水溶液中，采用顶空进样方式测得的灵敏度将大于直接进样；反之，例如甲醇与水互溶性好，直接进样的灵敏度将大于顶空进样。测定二氯甲烷、三氯甲烷等卤代烃时，如果溶剂为水，直接进样容易造成FID检测器灭火，此时优选顶空进样。无论是采用细口径或粗口径，均可选择不分流进样，提高灵敏度。当然，采用不分流进样也要考虑溶媒性质，挥发性太大的溶媒对色谱柱污染较大。直接进样要考虑样品性质。顶空进样体积可达到2ml气体，而直接进样只能1至3ul液体。八、提高灵敏度对于限度要求很严格的溶剂，或贵重样品取样量有限制时，或检测器对该溶剂灵敏度低的情况下＊，采取一些措施提高灵敏度是方法成败的关键。溶剂温度不分流进样顶空瓶体积利用盐析作用，即在水溶液中加入无机盐（硫酸钠）来改变挥发性组分的分配系数。常用高浓度，甚至用饱和浓度。盐析作用对极性组分的影响远大于对非极性组分的影响。例如在水溶液样品溶剂中加入0.01mol/L氯化钠溶液可使甲醇、乙醇灵敏度提高5倍（这种方法不常用）。在有机溶液中加入水，可以减少有机物在有机相中的溶解度，增大其在顶空气体中的含量（常用）。例如采用FID检测器测定三氯甲烷，DMF为溶媒，顶空进样1ml气体，分流比5：1，限度浓度的对照品溶液检不出峰。改为：水为溶媒，三氯甲烷用少量乙醇溶解，水稀释至刻度，顶空进样2ml气体，不分流进样，结果限度浓度的对照品溶液可检出很明显的色谱峰，灵敏度可达到限度的五十分之一。九、改善分离度程序升温增大分流比十、未知峰归属对于供试品色谱图中出现的未知峰，应进行确认。首先分析是否为样品裂解峰，其次核实是否为应控制溶剂，可采用双柱定性方式。十一、方法验证方法的线性范围主要由检测器的特性决定检测限由检测器、方法决定回收率加样回收率重复性、中间精密度和重现性药检所残留溶剂方法复核内容、常见问题及处理一、复核内容灵敏度用申报方法检验所提供样品，比较结果二、常见问题及处理措施灵敏度低，限度溶液不出峰（源于检测器或方法）分离度不好；样品出峰并与溶剂峰不能达到基线分离；图谱基线不好杂峰多（柱温、色谱柱或进样方式）溶媒不合适供试品配制方法不当较大未知峰应进行归属复核结果不合格方法评价一、首先关注待测溶剂有哪些？是否有下述三类溶剂：卤代烃（三氯甲烷、四氯化碳）氮/磷化合物（DMSO、DMF）限度小的溶剂（苯、四氢呋喃等限度小于0.0X％）如果有上述物质应警惕方法的灵敏度是否能达到检测限度要求。二、是否使用了专属检测器？FID：有机物ECD：卤代烃（三氯甲烷、四氯化碳等）NPD：氮/磷化合物（DMF、DMSO等）同时具备上述三种检测器的实验室不多。请注意下述三点：四氯化碳必须用ECD！不可用FID＋填充柱检查前述三类物质，灵敏度低使用ECD进行分离度试验应考虑非卤代烃！三、溶媒根据原料溶解性，溶媒是否能溶解样品？水、DMF、DMSO、不挥发酸碱溶液，不可使用盐酸液和氨水，顶空进样可选择在80~90°C加热能溶解样品的试剂。其次溶媒是否能溶解待测溶剂？苯、甲苯、三氯甲烷等水溶性不好的溶剂，可先用少量乙醇或甲醇溶解待查溶剂再用水稀释。前述三类溶剂如果顶空进样应选择K小的溶媒！不主张使用污染性大、毒性大的溶媒！四、供试品制备不可研磨样品，必须原态取样不可超声、不能加热溶解样品样品置顶空瓶中压盖后可以超声、加热样品与对照品配制方法一致，避免基质效应前述三类溶剂取样量尽可能大，至少0.1g/ml五、进样方式进样方式首选顶空，基线干净卤代烃直接进样容易灭火六、限度ICH限度并不是最高要求建议三类溶剂根据实际情况尽量提高限度总量应控制七、方法验证方法的线性范围主要由检测器的特性决定检测限由检测器、方法决定回收率加样回收率重复性和重现性前者容易实现，后者更重要，是方法验证必须考察的。请提宝贵意见！