医学免疫学 酶免疫技术

酶免疫技术基本概念•抗原抗体反应具有高度特异性•酶对底物反应具有高效催化性•酶免疫技术是将两者有机的结合起来–通过化学方法将酶与抗原（抗体）连接，形成酶标物–抗原抗体反应后，观察酶所对应的底物显色情况•检测方法具有高度特异、高度灵敏的优点•按应用的实际目的分为–酶免疫组织化学技术（EIHCT）•用于组织切片或其他标本中的抗原定性、定位的检测–酶免疫测定（EIA）酶免疫测定•用于检测标本中抗原（抗体）定性或定量的检测Ag-E+AbE-Ag-Ab游离的抗原、抗原抗体复合物上都有酶分子反应结束后，免疫反应的进行与否及程度，通过反应体系中的酶活性来体现均相酶免疫测定特殊设计的酶标物，使反应结束后，不需分离游离和结合状态的酶标物，即可对反应作出判定非均相酶免疫测定需分离游离和结合状态的酶标物，通过检测结合状态的酶活性，对反应作出判定ELISA•基本原理–将抗原（抗体）连接在固相载体上，保留免疫学活性–将抗原（抗体）与酶连接，形成酶标物，保留各自的活性–按一定的步骤在固相载体上，分别加入待测标本和酶标物–充分反应后，通过洗涤去除游离物质–在固相载体上加入底物，测定底物的显色情况（肉眼、酶标仪）对待测物质作出定性或定量的判定技术要点•包被•酶结合物及底物•洗涤液•酶标仪包被•将抗原（抗体）连接在固相载体上的过程称为包被•固相载体的选择–对蛋白质有较强的吸附力–本身不参加免疫反应或化学反应–空白值低、孔底透明–价格低廉、来源广泛–聚苯乙烯制成的微量反应板为最常用的固相载体•过程–确定免疫吸附剂（抗原、抗体）最适工作浓度–将抗原/抗体用50mmol/LCB溶解至最适工作浓度加至固相载体上，4℃过夜或37℃2～6小时，洗涤–用无关的蛋白质对反应板上未被占据的空隙进行封闭，洗涤，低温下保存固相Ag固相Ab酶结合物•酶的选择–活性高、性质稳定–作用专一、受检标本对酶活性影响小–易与抗原（抗体）结合，保留各自活性–检测酶活性方法简单、灵敏，底物易配制、保存–酶、辅助因子及底物对人体无害–酶及底物价廉、来源广泛–辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）常用酶结合物•HRP–分子量小（40KD），易透入细胞–标记方法简单–性质稳定（pH、温度、有机溶剂）–易溶–价格便宜、易得–底物种类多–内源性的过氧化物酶有干扰、某些化学物质抑制其活性•标记方法–改良过碘酸钠标记法HRP-CH2-OHNaIO4HRP-CHO+H2N-IgGHRP-CH2-NH-IgG-戊二醛交联标记法底物•HRP催化的反应H2O2＋DH2（无色）＝2H2O＋D（有色）•ELISA中常用的底物OPDTMB保存避光稳定不稳定，现配产物黄色、可溶蓝色、可溶，加终止液后变黄色比色波长492nm450nm免疫组化中常用的底物为DAB，被酶作用后生成棕色不溶物质洗涤液•由表面活性物质吐温20（Tween20）与缓冲液组成•作用–增强抗原抗体的结合–去除未结合的游离物质–减少非特异性吸附•注意事项–加洗涤液后静置数秒–勿溢出至其它孔，导致孔间污染–每次需将洗涤液拍干–洗涤次数为4～5次酶标仪•ELISA试验结果根据底物的显色情况加以判定•按要求需用酶标仪进行检测•酶标仪是通过检测反应孔中液体吸光度来判断颜色的深浅•注意事项–比色前需加终止液•常用2mol/L硫酸或盐酸•目的终止酶促反应、促使吸收峰转变–阴性对照测定值对结果的判断至关重要•已知不含待测物的标本为阴性对照品•除竞争法外，结果判定为A待测/A阴性≥2.1待测标本判为阳性A待测/A阴性＜2.1待测标本判为阴性ELISA的技术类型•检测抗原–双抗体夹心法–双位点一步法–竞争法–双夹心法–桥联法•检测抗体–间接法–双抗原夹心法–竞争法–桥联法–捕获法双抗体夹心法原理Ag固相抗体酶标抗体底物显色AgAg无关抗原洗涤液AgAg如待测标本中有相应抗原最后形成固相抗体、待测抗原和酶标抗体复合物，加底物显色，结果判定为阳性。显色深浅正比于待测抗原的浓度用于大分子抗原的检测。例：HBsAg、HBeAg双位点一步法•原理–为双抗体夹心法的改良–待测抗原必须具有两个以上的决定簇–固相抗体、酶标抗体为分别针对待测抗原两个不同决定簇的单克隆抗体，称为双位点–将待测抗原与酶标抗体同时加入反应孔中，为一步法–注意可能出现钩状效应钩状效应•在ELISA双位点一步法中待测抗原浓度过高导致结果的假低值甚至假阴性，它不同于带现象固相抗体AgAg酶标抗体洗涤液Ag酶标抗体底物必要时，可将标本进行稀释，以消除钩状效应竞争法•原理无抗原固相抗体固相抗体底物底物显色为阴性、不显色或显色浅为阳性，待测抗原的含量与显色的深浅成反比。用于小分子抗原的检测双夹心法•原理固相抗体洗涤液AgAgAgAg无关抗原Ag第一抗体酶标抗抗体底物显色避免对特异性抗体的标记，但增加了操作步骤桥联法•原理固相抗体Ag第一抗体桥联抗体E酶抗酶抗体复合物底物显色第一抗体和抗酶抗体为同一物种的抗体、桥联抗体为抗抗体本法为非标记的酶免疫技术，避免酶对抗活性的影响，操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好EE酶抗酶抗体复合物抗酶抗体间接法•原理待测抗体酶标抗抗体底物显色固相抗原为检测抗体常用的方法双抗原夹心法•原理固相抗原待测抗体底物显色两对半检测中，抗-HBs用此法检测竞争法•原理抗原的固相化固相抗原固相抗体＋AgAg无待测抗体底物显色有待测抗体底物捕获法•原理抗-μ抗体Ag底物显色IgM用于特异性IgM的检测