3----2010药典

2010年版药典附录无菌检查和微生物限度检查方法存在问题及修定内容QC微生物组王燕杜老师简介原任青岛药检所微生物室主任，主任药师，担任2010年版药典编写与审定稿工作，并承担2010年版药典三部起草工作。起草的指导思想着力解决发展中的问题,提高我国药品标准总体水平，着力提升《中国药典》在国际社会中的地位和作用，提高综合竞争力，2010年版无菌检查法一、进一步确定了无菌检查法的定义：无菌检查法系用于检查要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。应以一次检验为准，不允许复测二、进一步明确了无菌检查保障1、检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，但采用的措施不得影响微生物的生长。2、无菌检查环境检测日常检验还需进行环境检测。3、无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。三、培养基1.删去硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基的使用范围。2.删去选择性培养基使用的表面活性剂种类3.目的：扩大使用范围4.选择应验证需使用的表面活性剂3、培养基灵敏度试验⑴菌悬液制备中黑曲霉菌悬液的制备“用适宜的方法吸出孢子悬液”。⑵在稀释液0.9%无菌氯化钠溶液中加入0.05％v/v）聚山梨酯80。注：起到过滤作用，菌丝体吸出后会搅乱结果，只需孢子菌液。制备均匀的孢子悬液，对孢子的损坏减小。四、试验稀释液、冲洗液⒈增加根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。⒉试验中使用的中和剂、灭活剂和表面活性剂除证明其有效性外还应证明对污染的微生物无影响修改为无毒性。3.稀释液：pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液；0.1%蛋白胨缓冲液；0.9%氯化钠溶液。其中pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液回收率最高，故基本选择此缓冲液。0.9%氯化钠溶液在05版药典时已取消，专家经过一系列的验证，回收较低，与国际更不接轨。五、方法验证试验⒈试验菌株大肠埃希菌替代铜绿假单胞菌⒉供试品用量薄膜过滤法取每种培养基规定接种的供试品总量。3.经验证证明，大肠埃希菌对很多菌敏感，铜绿假单胞菌只对个菌敏感，故替代。六、供试品的无菌检查法⒈检验量直接接种法除另有规定外，每份培养基接种的供试品量按表2、表3规定。⒉薄膜过滤法⑴滤膜选择抗生素供试品滤膜应选择低吸附的滤器及滤膜。⑵冲洗量每张滤膜每次冲洗量一般为100ml，总冲洗量不得超过1000ml。①水溶液供试品含抑菌成分所用的冲洗量、冲洗方法同方法验证试验。（3）在检测抗生素样品时，在冲洗时，抗生素会吸附在滤膜上，没法达到冲洗目的，故应购买低吸附的滤膜。（4）每张膜最大冲洗量为1000ml，不包括供试品的量。微生物限度检查1、培养条件控制菌培养温度30℃～35℃。2、结果报告特殊品种可以最小包装单位报告特殊品种包括∶⑴药典规定微量包装药品的检验量可以酌减。⑵一些贵重药品也应考虑检验量。3、控制菌与细菌检验温度一致，这是专家验证的结果。30～35℃适宜细菌及其它菌的生长，故修改。4、特殊品种：对于微量包装药典规定，贵重药品可酌减检验量。3、检验量⑴中药膜剂检验量100cm2。⑵沙门菌检验量为20g或20ml（其中10g用于阳性对照）。4、供试液的制备⑴供试品检查时使用表面活性剂应证明其对微生物生长和存活无毒性。⑵供试液的制备若需加温时，可采用其他经验证的方法，但应均匀加热，且温度不应超过45℃。①离心沉淀集菌法500转/分离心，不超过3分钟，取全部上清液用于检查。影响因素供试品污染菌特性适用范围⒈仅使用于微生物限度检查供试液的制备。⒉尽量避免使用，不可使用快速离心。细菌、霉菌及酵母菌计数⒈计数培养基的适用性检查⑴菌种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉大肠埃希菌：好氧菌，革兰阴性杆菌金黄色葡萄球菌：好氧菌、革兰阳性球菌枯草：芽孢（最好分离、鉴定）白念：酵母菌（假丝）黑曲霉：黑曲霉①菌悬液的制备及保存条件。菌悬液制备后在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可以在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，按规定条件培养计数，同时用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。②对照培养。黑曲霉孢子悬液对环境抵抗力强，可以延长时间，但以验证为准。6、供试品检查⑴平皿法采用平皿法进行菌数测定时，按计数方法的验证试验确认的程序进行供试液制备。根据验证需要，标准不要求几个级，选择三个级别，可选择最高级报告。注：只做一个稀释级也符合要求。⑵培养时间除另有规定外，细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天，必要时，可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。细菌：有部分为休眠状态，与国际接轨，迟缓生长菌落的判定⑶菌数报告规则1.若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。2.细菌、酵母菌和霉菌平均菌落数在选取菌落数小于300cfu和100cfu的稀释级作为菌数报告的依据。3.“cfu”指菌落形成单位“个”菌为单个⑷薄膜过滤法采用其它直径的滤膜，冲洗量应相应的进行调整,总冲洗量不得超过1000ml。7、控制菌检查⑴控制菌检查用培养基的适用性检查；检查项目包括促生长、抑制及指示能力检查参照表2⑵培养基适用性检查方法①液体培养基促生长能力检查。②固体培养基促生长能力检查。③培养基抑制能力检查。④液体培养基指示能力检查。⑤固体培养基指示能力检查。试验结果与对照培养基比较控制菌检查用培养基的适用性检查控制菌检查用培养基的促生长、抑制及指示能力检查控制菌检查培养基特性试验菌株大肠埃希菌胆盐乳糖促生长能力大肠埃希菌抑制能力金黄色葡萄球菌MUG促生长能力+指示能力大肠埃希菌曙红亚甲蓝或麦康凯促生长能力+指示能力大肠埃希菌大肠菌群乳糖胆盐促生长能力大肠埃希菌抑制能力金黄色葡萄球菌乳糖发酵促生长能力+指示能力大肠埃希菌曙红亚甲蓝或麦康凯促生长能力+指示能力大肠埃希菌沙门菌营养肉汤促生长能力乙型付伤寒沙门菌四硫磺酸钠亮绿促生长能力乙型付伤寒沙门菌抑制能力金黄色葡萄球菌胆盐硫乳琼脂或沙门、志贺氏属琼脂培养基促生长能力+指示能力乙型付伤寒沙门菌曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂培养基促生长能力+指示能力乙型付伤寒沙门菌三糖铁琼脂培养基指示能力乙型付伤寒沙门菌1、培养基去掉一些凝集水（可以放35～37℃培养箱内2小时可去掉）2、培养时间的掌握，抑制能力，加最高要求在最长时内培养，若未生长菌就达到要求，促生长能力：加最少的菌培养最短时间报告。⑶控制菌检查法①疑似致病菌的确证微生物控制菌检查中没有规定进一步确证疑似致病菌的方法。选择已被认可的菌种鉴定方法。如《伯杰氏细菌鉴定手册》。②控制菌检查方法验证删去阴性菌对照组。③大肠菌群检查用培养基为乳糖胆盐。④改梭菌检查用梭菌增菌培养基。⑤梭菌培养时间为48小时。微生物限度检查法指导原则一、抑菌剂效力检查法指导原则二、药品微生物检验替代方法验证指导原则三、微生物限度检查法应用指导原则四、药品微生物实验室规范指导原则二、药品微生物检验替代方法验证指导原则⒈目的⑴是为所采用的试验方法能否替代药典规定的方法用于药品微生物的检验提供指导。⑵在控制药品微生物质量中，需要采用替代方法时，应进行方法的验证，确认其应用效果优于或等同于药典的方法。四、药品微生物实验室规范指导原则⒈目的该指导原则用于指导药品微生物检验实验室的质量控制。⒉药品微生物的检验的对象具特殊性；活的生物、分布不均匀、重现性差必须使用经验证的检测方法并严格按照药品微生物实验室规范要求进行试验。⒊药品微生物实验室规范包括以下几个方面人员、培养基、菌种、实验室的布局和运行、设备、文件、实验记录、结果的判断等。⑴人员从事药品微生物试验工作的人员应具备微生物学或相近专业知识的教育背景。①检验人员和管理人员培训进行岗前培训检验人员技能培训:熟悉相关检测方法、程序、检测目的和结果评价。管理人员①其专业技能和经验水平应与他们的职责范围相符不断接受系统的教育与职责范围相关的培训。②客观评估检验人员的能力，必要时对其进行再培训并重新评估。