miRNA的提取与检测

TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTDmiRNA提取与检测市场部赵丁主要内容什么是miRNA？miRNA的作用miRNA的研究路线miRNA的提取及检测4123miRNA的发现1993年，Ambros在线虫中克隆了lin-4基因，并通过定点突变发现lin-4并不编码蛋白，而是产生一种小RNA分子。这种小RNA分子能以不完全互补的方式与其靶mRNA的3‘非翻译端的特定区域相互作用来抑制lin-14的表达,最终导致lin-14蛋白质合成的减少,这种现象叫做转译抑制。lin-4控制着线虫幼虫由L1期向L2期的转化。同时，Ruvkun也发现了lin-4对lin-14的作用。TheC.elegansheterochronicgenelin-4encodessmallRNAswithantisensecomplementaritytolin-14.Cell,1993miRNA的奠基者姓名单位研究对象VictorAmbros麻省大学医学院秀丽线虫GaryRuvkun麻省总医院秀丽线虫DavidBaulcombe英国哥伦比亚大学植物miRNA相关文献数量miRNA的相关文献文章名称期刊时间IFAncientanimalmicroRNAsandtheevolutionoftissueidentityNature2010.2.25OpposingmicroRNAfamiliesregulateself-renewalinmouseembryonicstemcellsNature2010.2.4TranscriptionalControlofGeneExpressionbyMicroRNAsCell2010.1.8MicroRNA-206DelaysALSProgressionandPromotesRegenerationofNeuromuscularSynapsesinMiceScience2009.12.11TherapeuticSilencingofMicroRNA-122inPrimateswithChronicHepatitisCVirusInfectionScience2009.12.4ActiveturnovermodulatesmaturemicroRNAactivityinCaenorhabditiselegansNature2009.9.24TUT4inConcertwithLin28SuppressesMicroRNABiogenesisthroughPre-MicroRNAUridylationCell2009.8.21ArgonauteHITS-CLIPdecodesmicroRNA–mRNAinteractionmapsNature2009.7.23TheRNA-bindingproteinKSRPpromotesthebiogenesisofasubsetofmicroRNAsNature2009.6什么是miRNA？miRNAs（MicroRNAs）是一种不编码蛋白质，大小约21-23nt的单链小分子RNA。它具有在翻译水平或转录后水平调控基因表达的功能。miRNA的合成过程基因组DNAPri-miRNA（可达1000nt）Pre-miRNA（70～100nt）成熟miRNADicer酶Drosha酶RNA诱导沉默复合物调控基因表达Exportin5miRNA与靶mRNA的作用模式1）二者不完全互补。即二者不完全时配对结合时，主要影响翻译过程，而对mRNA的稳定性无任何影响。如线虫的lin-42）二者完全互补。即二者完全配对结合后，类似siRNA与靶mRNA的结合，特异性的切割mRNA。如miR-39/miR-1713）上述两种模式均具备。当其与靶mRNA完全互补配对时，直接靶向切割mRNA，而不完全互补配对时起调节基因翻译的作用。如let-7果蝇/线虫miRNA的特点•结构特异性：茎环结构前体，无ORF•高度保守性：结构和物种•时空特异性：发育与分化•表达统计：60%的miRNAs为独立表达15%的miRNAs成簇表达25%的miRNAs位于内含子miRNA的作用miRNA物种作用文献miR-1果蝇敲除导致果蝇在二龄幼虫期死亡,肌肉畸形,体型变小Genes&DevmiR-273线虫调控神经元不对称发育.NaturemiR-451斑马鱼影响红细胞的成熟PNASmiR-1小鼠调控心肌分化NaturemiR-398拟南芥抗氧化胁迫PlantCellmiRNA的主要作用在胚胎发生，发育时序，器官分化，程序性细胞死亡和生长控制（癌症）。miRNA研究方法•生物信息学•构建miRNA文库•miRNA芯片•荧光定量PCR•Nothernblot•原位杂交•其它方法生物信息学用途数据库/软件名称miRNA数据库miRBase，noncodedatabase……miRNA的确认MiRscan，miRseeker，Mfold……靶mRNA的确认RNAhybrid，TargetScan，miRanda……生物信息学实验验证miRNA芯片的公司ExiqonilluminaAffymetrixPhalanxFebitLCSciencesAgilentCapitalBioSignosis构建miRNA文库总RNA按片段大小分离（PAGE）-OH3’5’P-磷酸酶-OH3’5’HO-T4多核苷酸激酶T4RNA连接酶T4RNA连接酶逆转录，PCRBanI消化，再连接5’HO--P3’-P3’5’P-5’P--P3’-OH3’-P3’酶切位点-P3’酶切位点酶切位点连接到载体并测序生物信息学实验验证提取miRNAmiRNA研究路线miRNA芯片选择样品miRNA文献检索转染沉默表达荧光定量PCR过量表达靶mRNA生物信息学抽提和吸上清沉淀RNAPAGE电泳裂解过柱洗脱miRNA的提取切胶回收裂解miRNA的提取•后续实验反应酶活•无法通过紫外来检测•信息的完整性•无法通过紫外和电泳来检测•-20度或-70度冻存•相对RNA来说，不易降解纯度得率保存miRNA提取后的检测•对于少量血清/血浆提取，一般不建议进行紫外检测和电泳检测。对于低浓度的miRNA利用吸光值来确定miRNA浓度偏差较大，在有些时候仪器本身的误差即可造成测定结果的不准确。电泳的灵敏度更低，在很多情况下凝胶上并不会出现条带。对于组织/细胞的提取，电泳时会出现明亮的条带，但条带中更多的是5SRNA和tRNA，紫外检测值无法准确的反映出miRNA的含量。盐分的残留天根DP501PEG分离DP501可以显著的降低盐分的残留（230nm）。反转录方法——茎环反转录方法——加尾荧光定量PCR灵敏度特异性内参基因5SrRNAU6ABCPg级总RNA单碱基差异TIANGEN公司miRNA产品线miRNA提取miRNA加尾后反转录miRNA荧光定量检测miRcutemiRNA提取分离试剂盒（DP501）样本：组织、细胞、血清、血浆等。采用不同的protocol，可提取miRNA，也可提取总RNA。miRcutemiRNA第一链合成试剂盒（KR201）通过对miRNA进行Poly（A）加尾，在已知序列的引物下，进行反转录，获得miRNA的cDNA。miRcutemiRNAqPCR检测试剂盒（SYBRGREEN）（FP401）高特异性（专利的抗体酶技术）、高分辨率（单碱基差异）、高灵敏度（pg级的总RNA）。DP501对比实验samplemiRNA检测Ct(Tiangen)检测Ct(Ambion)血清Mir-1621.9324.47Mir-2425.3828.87血浆Mir-1618.1917.04Mir-2420.0818.66利用DP501提取20余样品未发现堵柱现象DP501、KR201和FP401实验结果y=-3.5x+33.4R2=0.9970.05.010.015.020.025.030.035.020pg200pg2ng20ng200ng2ugmouselivertotalRNACtmir-12210倍倍比稀释的扩增曲线、融解曲线和标准曲线TEL：8601059822665/2661800-990-6057TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD.THANKYOU!