华南农业大学-LDH同工酶圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳

实验四LDH同工酶圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳一、实验目的：•1.了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程及结构特点。•2.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及分离乳酸脱氢酶同工酶的电泳过程。二、实验原理•1.聚丙烯酰胺凝胶原理及影响因素（同实验三）•2．聚丙烯酰胺凝胶电泳原理（同实验三）•3.乳酸脱氢酶(LDH)同工酶圆盘电泳•同工酶是指生物体中结构和性质不同而能催化相同反应的一类酶。许多酶都具有同工酶（约占已知酶的40～50%），凝胶电泳可利用同工酶结构上的差异而将之分离。•乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase简称LDH，EC.1.1.1.27）是催化丙酮酸和乳酸可逆转化的酶。•1959年Markert等用电泳的方法将牛心肌提纯的LDH结晶分离出5条区带，靠近阳极一端的称LDHl，靠近阴极一端的称为LDH5；其余3种，由阳极到阴极依次命名为LDH2，LDH3及LDH4。它们均具有LDH催化活性，从而首先提出了同工酶(isoenzyme)的概念。•目前已知LDH同工酶是由亚基及M亚基按不同比例组成的四聚体，它们是H4（LDHl），H3M（LDH2），H2M2（LDH3），HM3（LDH4）及M4（LDH5）5种。心肌中以LDHl含量高，骨骼肌及肝中LDH5含量高。LDH同工酶底物染色显色反应如下：反应式中PMS为甲硫吩嗪（phenazinemethosulfate），NBT为氯化硝基四氮唑蓝（nitrobluetetrazoliumchloride）的缩写，它们都是接受电子的染料。LDH与底物染色液在37℃温浴中脱下的氢最后传递给NBT生成蓝紫色的NBTH2称为甲膝，此物不溶于水，有利于显色后区带的保存，但可溶于氯仿及95%乙醇（9∶1）的混合液。因此电泳后的显色区带可通过浸泡法浸出，于560nm比色，也可用光吸收扫描仪得出LDH同工酶间的相对百分含量。目前，LDH及同工酶检测已广泛用于临床，作为某些疾病鉴别诊断的依据，常用醋酸纤维薄膜电泳，琼脂糖电泳及聚丙稀酰胺凝胶电泳分离LDH及共同工酶，这3种不同支持物电泳及染色原理完全相同，但灵敏度不同。三、实验材料、仪器和试剂•(一)实验材料（由老师准备）•兔子血清和组织(肝脏组织、心脏组织、肾脏组织、肌肉组织、肺等)提取液（组织重量与组织匀浆缓冲液体积比为1∶10（g/mL）。•组织样品处理：称取0.5克兔血清和肝脏等组织，各加入5mLPBS和少量石英沙于研钵磨成匀浆，离心10000r/10～15min，取上层清液4℃保存作为母液。•电泳样品：用移液枪各取1mL上述提取液，加1mL40%蔗糖溶液和20uL溴酚兰，混匀。•(二)仪器及器皿•1全班共用：•圆盘电泳槽直流稳压电电泳仪恒温水浴锅微量加样器移样器电炉等•电泳槽3个(12个管/个)，电泳仪3个，200mL烧杯10个，100mL容量瓶5个，1000mL容量瓶1个(或1000mL量筒1个)，广泛pH试纸，塑料大烧杯（2L）2个,塑料大烧杯（L）1个，剪细滤纸条1杯。•2每组配备•长滴管1支，玻管及乳胶管（带玻珠）2个，长针头注射器1支，试管2支，洗耳球1个，10mL离心管2个，玻棒。(三)、试剂1制备样品有关试剂（老师配）（1）0.01mo1／LpH6.5磷酸盐缓冲液（PBS），用于组织匀浆缓冲液及LDH的染色液Na2HPO4·12H2O0.2256g，NaH2PO4·H2O0.2137g，加水定容到200mL。（2）40%蔗糖溶液20g蔗糖用水溶解定容至50mL。（3）0.5％溴酚兰10mL2、制备PAGE的试剂（在通风橱里加浓HCl），每大组（3个小组）配以下试剂（1）凝胶贮备液A：称Tris（三羟甲基氨基甲烷）9g于100mL烧杯中，加浓HCl1mL，TEMED（四甲基乙二胺）原液0.18mL，于量筒加水定容至25mL，用试纸检测pH为8.9。（2）凝胶贮备液B：丙烯酰胺（Acr）15g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.4g;，加水于100mL烧杯中溶解，然后混合于容量瓶加水定容至50mL，如果有沉淀要过滤。（3）凝胶贮备液C：过硫酸铵0.14g，溶解后，于容量瓶加水定容至50mL（制胶时现配现用）。（4）电极缓冲液：Tris3g，甘氨酸16g，加蒸馏水溶解并定容至300mL，pH为8.3，使用时稀释10倍。（每个电泳槽可装1000mL的电极缓冲液，12支管/盘，3个圆盘/班）3、LDH同工酶染色贮存液(电泳过程中配制)(1)、5mg/mLNAD+（氧化型辅酶I）溶液：称400mgNAD+定容至80mL，置棕色瓶中，4°C可保存2星期。(2)、1mol/L乳酸钠（分子量112.06）：取60%乳酸钠4.6mL定容至50mL，置棕色瓶中，4°C度保存。(3)、0.1mol/LNaCl：取0.584gNaCl，加蒸馏水溶解并定容至100mL。(4)、1mg/mL甲硫吩嗪(PMS)：取甲硫吩嗪(PMS)25mgPMS，加蒸馏水溶解并定容至25mL。(5)、1mg/mL氯化硝基四氮唑蓝(NBT)溶液：160mgNBT，加蒸馏水溶解并定容至160mL,于棕色瓶4℃保存。每次用完请妥善保管。当黄色NBT变绿色或出现沉淀，不能再使用。（6）、0.01mol/LpH6.5PBS（磷酸盐缓冲液，全班共用的量）：Na2HPO4·12H2O0.2256g，NaH2PO4·H2O0.2137g，加水定容到200mL四操作步骤•1．凝胶柱的制备(每人做1条胶，玻璃管体积2mL，胶量1.5mL)•将凝胶贮备液A、B及水按1：2：1的比例混合于烧杯中，另量取4份的C液于另一烧杯中[注意：每6人配制如下：•1个烧杯配A：B：水＝1(3mL)：2(6mL):1(3mL)•另一烧杯配C液4份(12mL)•当准备好带有玻珠乳胶管封底的玻璃管后，可把两烧杯中的溶液混合，轻搅均匀，用长滴管沿玻管壁小心加到玻管中。胶液应灌到离管口约5～8mm处。用手指轻弹管壁，将管中胶液可能混有的气泡赶出，然后用滴管在胶液面上小心注入一层3～5mm蒸馏水，以防胶凝结时表面形成弯月面并隔绝空气。当见到水层与胶液交界处有一清晰界面时，表明胶已聚合。2、预电泳•将乳胶管从凝胶聚合后的玻管中小心拔出，用滤纸吸去凝胶上层的水，把凝胶管插入到圆盘电泳槽的槽洞橡皮塞中。上下槽中加入稀释好的约250mL电极缓冲液，并使两管口都不存气泡。•为防止LDH及其同工酶受凝胶聚合后残留物(如AP等)的影响，引起酶的钝化或其它人为效应，在加样前，应进行预电泳，电泳条件：以每管2mA的电流进行电泳，约15～30min。•3．加样和电泳（每人点1个样，样品：血、肝、肌肉、心、肾、肺）•关闭电源后准备加样，用2移液枪加样品(血加50uL，其它样品加25uL)。上槽接负极，下槽接正极，以每管2mA的电流进行电泳。当电泳指示剂溴酚蓝带迁移出凝胶柱30～60min时，可停止电泳。电泳时间约2～3.5h。•4．脱胶、染色和脱色•把从电泳槽中取出的凝胶管用带长针头的注射器脱胶。将吸满水的注射器针头沿壁插入玻管壁与凝胶之间，边注水边推进针头并缓慢旋转玻管，使凝胶与管壁分离，则凝胶柱自然滑出，若不能滑出可用洗耳球吹出。•（1）每个试管按下表1的顺序，在临用前将有关试剂混和配制约12mLLDH活性染液（每6人大组共配12×6＝72mL）。NAD+乳酸钠NaClNBTPMSPBS总体积（mL）每人用量（mL）21.21.250.52.512六人用量（mL）127.27.23031572表1LDH活性染色液（每组用量）•（2）把配好的染色液倒入试管中，脱出的凝胶放入盛有染色液的试管中,避光置37℃水浴中保温10～20min，待LDH同工酶呈现蓝紫色区带,回收染色液。•（3）用蒸馏水洗3次除去染色液，加入水浸泡，凝胶底色脱净，背景清晰，把凝胶柱放在灌满水的试管中，对光观察过乳酸脱氢酶同工酶谱，并画电泳图或拍照。•（也可将凝胶板放在保存液中浸泡）四.结果与分析•1对同工酶谱带进行绘图、记录或照相。•2分析健康兔子的各组织的LDH的差别，试分析原因。五.注意事项•1组织匀浆制备时一般用0.01mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液，此溶液需4℃预冷。组织重量（g）与缓冲液体积（mL）之比为1：5或1：10。用玻璃匀浆器在冰浴中匀浆、将匀浆液置离心管中10000r／min、离心10～15min，取上清液进行电泳。•2电泳时电流不要太高，应防止热效应引起LDH同工酶失活，有条件可冷却水降温或4℃电泳。•3LDH同工酶活性染色时间不要太长，一般以15～30min为宜，当大多数条带均显蓝紫色即可终止染色。