目的基因的获得

第五章目的基因的获得生命科学学院第五章目的基因的获得对于高等真核生物而言，基因组DNA十分庞大,基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列，因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因往往是未知基因，因此无法对它进行特异性扩增，而只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因文库，然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的基因。生命科学学院第五章目的基因的获得基因文库(genelibrary)概念又称DNA文库，是指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。按外源DNA片段的来源分基因文库分为：基因组DNA文库从特定组织提取的染色体基因组DNAcDNA文库mRNA反转录成的cDNA拷贝基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。生命科学学院第五章目的基因的获得生命科学学院一、基因组DNA文库的构建(一)基因组DNA文库的类型根据所选用的载体可以分为：质粒文库噬菌体文库粘粒文库人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库等）载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体系列：容量为24kpcosmid载体：容量为50kbYAC：容量为1MbBAC:容量为300kb生命科学学院一、基因组DNA文库的构建BamHIMboIOHPOHHO脱磷酸化重组DNAT4连接酶转化E.coli基因组文库总DNAHindIIIBamHISalIEcoRIPstIScaITcAmpRRpBR322(4.36kb)OriHindIIIEcoRIPstIScaIAmpROriSalI用质粒载体构建基因组文库的流程该法简单、快速、易于操作，但仅适合一些低等真核生物和原核生物。生命科学学院一、基因组DNA文库的构建用λ噬菌体载体构建基因组文库的流程生命科学学院一、基因组DNA文库的构建用黏粒载体构建基因组文库的流程生命科学学院一、基因组DNA文库的构建用酵母人工染色体构建基因组文库的流程生命科学学院一、基因组DNA文库的构建用酵母人工染色体构建基因组文库的流程生命科学学院一、基因组DNA文库的构建生命科学学院一、基因组DNA文库的构建(二)基因组DNA文库的质量标准一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力。载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆。克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序。克隆片段易于从载体分子上完整卸下。重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。生命科学学院一、基因组DNA文库的构建(三)基因组DNA文库构建的程序1.载体DNA的制备；2.高纯度大相对分子质量基因组DNA的提取和大片段的制备；3.高纯度大相对分子质量基因组DNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离；4.载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；5.重组克隆的挑选和保存。生命科学学院一、基因组DNA文库的构建(三)基因组DNA文库构建的程序1．载体DNA片段的制备DNA分离纯化→限制酶切→脱磷酸化反应2．供体DNA片段的制备总DNA分离纯化→物理切割法[超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）]或酶切法（内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。）→分离特定大小DNA片段超声波～300bp，剧烈搅拌：～8Kb部分酶切完全酶切酶法分离特定大小DNA片段生命科学学院一、基因组DNA文库的构建DNA的不完全酶切目的片段低熔点琼脂糖回收生命科学学院一、基因组DNA文库的构建(三)基因组DNA文库构建的程序3.载体与基因组DNA大片段的连接直接连接、人工接头或同聚物加尾。（1）粘性末端直接连接：载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A与BamHI的酶切末端。（2）人工接头法（adapter）人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。接上人工接头粘性末端各种酶的接头可以向公司定做或购买。生命科学学院一、基因组DNA文库的构建(三)基因组DNA文库构建的程序3.载体与基因组DNA大片段的连接（3）同聚物加尾粘性末端CCCCCC末端转移酶生命科学学院一、基因组DNA文库的构建(三)基因组DNA文库构建的程序4.重组DNA转化受体细胞（1）根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞常见的宿主细胞：DH5:用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷型的抑制型菌株，可与pUC编码的－半乳糖苷酶氨基端实现互补。HB101:用于大规模制备质粒的抑制型菌株，转化效率高JM101:可支持带有琥珀突变载体生长的宿主菌JM109:支持带有琥珀突变载体生长的重组缺陷的抑制型菌MZ-1:温度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌体ＰＬ启动子质粒载体的宿主菌生命科学学院一、基因组DNA文库的构建生命科学学院一、基因组DNA文库的构建(四)基因组文库的大小理论值:基因组文库的克隆数目＝基因组DNA总长/DNA插入片段的平均长度。例如：细菌基因组DNA总长度=3×106kb酶切后的DNA片段平均长度=15kb基因组文库的克隆数=3×106kb/15kb=2×105个克隆生命科学学院一、基因组DNA文库的构建(四)基因组文库的大小（必须包括一定数量的重组子才可能克隆基因组中的任何碱基序列。）经验值：N—基因组文库克隆总数P—在基因组文库中目的基因DNA片段的出现概率f—插入片段大小与基因组DNA大小比值N=Ln(1–P)Ln(1–f)生命科学学院一、基因组DNA文库的构建ln(1-0.99)ln[1-(2×104/4.6×106)]Nhuman==6.9×105ln(1-0.99)ln[1-(2×104/3×109)]这个例子说明用质粒载体（插入片断5-10kb）就可以建立很好的原核生物基因文库，只需要几千个克隆；而真核生物则需要更大承载能力的载体。NE.coli=＝1.1×103Forexample:期望值为0.99，插入片断为20kb的E.coli(4.6×106bp)和human(3×109bp)基因组的克隆数的计算生命科学学院一、基因组DNA文库的构建克隆片段平均大小（bp）基因组大小/bp2×106（细菌）2×107（真菌）2×109（动物）理论克隆数实际克隆数理论克隆数实际克隆数理论克隆数实际克隆数5×1034001831400018418600000276311010×10320091920009208300000138155020×1031004581000460315000069077440×10350278500230075000345386基因组文库应具有的克隆子数生命科学学院一、基因组DNA文库的构建(五)DNA文库的保存1、影印膜滤保存法生命科学学院一、基因组DNA文库的构建(五)DNA文库的保存2.液体培养基中扩增保存方法：从平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于-70oC储存（加终浓度为25%的甘油）。缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过多或过少。生命科学学院一、基因组DNA文库的构建(五)DNA文库的保存3.保存单个克隆子于含有甘油的培养基中方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于-70oC或-25oC下保存。缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大生命科学学院二、cDNA文库构建真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列。采用电泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。高等生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，都尽有15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。生命科学学院二、cDNA文库构建cDNA以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反转录酶引物cDNAlibrary利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。生命科学学院二、cDNA文库构建cDNA文库的特点（1）不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达（一般选用的载体都是表达型的）。（3）包含了所有编码蛋白质的基因。（4）比DNA文库小的多，容易构建。cDNA文库既有种属特异性，也有组织特异性。基因特异性、器官特异性、代谢或发育特异性生命科学学院二、cDNA文库构建(一)cDNA基因文库构建的步骤1.细胞总RNA的提取和mRNA的分离2.第一条cDNA合成3.第二条cDNA合成4.双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖生命科学学院二、cDNA文库构建基因重组反转录酶mRNAcDNA生命科学学院二、cDNA文库构建(一)cDNA基因文库构建的步骤1.总RNA（totalRNA）提取和mRNA的分离纯化提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。mRNA的分离纯化（1）原理利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-2%。（2）mRNA的分离纯化Column（柱）分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。生命科学学院二、cDNA文库构建mRNA的分离纯化生命科学学院二、cDNA文库构建(一)cDNA基因文库构建的步骤1.cDNA第一链合成逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。用OligodT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。反转录酶mRNAcDNA3’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物生命科学学院二、cDNA文库构建降解mRNA模板用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’5’5’反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’3’5’5’引物cDNA第一链3’5’引物或RNaseH碱生命科学学院二、cDNA文库构建(一)cDNA基因文库构建的步骤3.cDNA第二链合成（自身引导法和置换合成法）剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。cDNA第一链5’cDNA第二链合成DNA聚合酶cDNA第一链cDNA第二链5’3’生命科学学院二、cDNA文库构建去掉发卡结构用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。核酸酶S1cDNA第一链cDNA第二链5’3’cDNA第一链cDNA第二链5’3’5’3’生命科学学院二、cDNA文库构建1．自身引导法生命科学学院二、cDNA文库构建生命科学学院二、cDNA文库构建妙用RNaseH这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。DNAPolI除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。生命科学学院二、cDNA文库构建mRNAcDNA第一链3’5’引物mRNAcDNA第一链3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二链cDNA第一链3’5’RNaseHDNAligase去引物生命科学学院二、cDNA文库构建置换合成法生命科学学院二、cDNA文库构建生命科学学院二、cDNA文库构建(一)cDNA基因文库构建的步骤4.cDNA与载体连接与转化受体细胞同基因组文库相似生命科学学院二、cDNA文库构建cDNA文库构建的特殊方法Okayama