第八章 核酶和抗体酶

退出EnzymeEngineering酶工程第八章核酶和抗体酶第一节核酶第二节脱氧核酶第三节抗体酶第一节核酶一、核酶的发现二、核酶的种类三、核酶的应用现状1982年美国T.Cech等人发现四膜虫的rRNA前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发现RNA有催化活性ThomasCechUniversityofColoradoatBoulder,USA一、核酶的发现1983年美国S.Altman等研究RNaseP（由20%蛋白质和80%的RNA组成），发现RNaseP中的RNA可催化E.colitRNA的前体加工SidneyAltmanYaleUniversityNewHaven,CT,USA一、核酶的发现Cech和Altman各自独立地发现了RNA的催化活性，并命名这一类酶为ribozyme（核酶），2人共同获1989年诺贝尔化学奖1．Cell,vol31,147～157,19822．Sci.Amer.,Vol255,64～75,1986二、核酶的种类剪接型核酶剪切型核酶根据催化反应锤头核酶I型内含子II型内含子发夹核酶丁型肝炎病毒（HDV)核酶RNaseP1、剪接型核酶剪接型核酶的作用机制是通过既剪又接的方式除去内含子(Intron)Ⅰ型内含子：均与四膜虫的核rRNA前体的内含子结构相似，催化自我剪接需鸟苷（或5′鸟苷酸）和Mg2+(Mn2+)参与Ⅱ型内含子：结构与四膜虫的不同，而与细胞核mRNA前体中的内含子相似。它催化自我剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参与，但仍需Mg2+2、剪切型核酶只剪不接(1)自身催化剪切型RNA(2)异体催化剪切型RNA(1)自身催化剪切型RNA剪切机制类型锤头型发夹结构HDVRNA核糖核酸酶P(RNaseP)。是核糖核蛋白体复合物，能剪切所有tRNA前体的5’端，除去多余的序列，形成3’-OH和5’-磷酸末端由M1RNA和蛋白质亚基组成体外：M1RNA具催化作用蛋白质作为辅助因子体内：M1RNA和蛋白质对酶活性都是必需的M1RNA5’端完整结构对维持催化活性是必需的。反应需Mg2+参与(2)异体催化剪切型RNA三、核酶的应用现状1、核酶在医学上的应用•核酶抗肝炎病毒的研究目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）以及HDV作用的研究。人工设计核酶多为锤头状结构，少部分是采用发夹状核酶•抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-Ⅰ)核酶1998年，美国加利福尼亚大学Wong-Staal等利用发夹核酶抑制HIV-Ⅰ基因表达，并率先进入临床Ⅰ期•抗肿瘤治疗核酶能在特定位点准确有效地识别和切割肿瘤细胞的mRNA,抑制肿瘤基因的表达，达到治疗肿瘤的目的三、核酶的应用现状1、核酶在医学上的应用特点通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强免疫源性低，很少引起免疫反应针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运三、核酶的应用现状2、在其他领域的应用防治动、植物病毒侵害：马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶构建，马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变核酶的克隆等三、核酶的应用现状核酶技术面临的问题核酶催化切割反应的可逆性问题提高催化效率寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞使核酶在细胞内有调控地高效表达增强核酶在细胞内的稳定性对宿主的损伤问题有待进一步考察第一节结束核酶的发现核酶的种类核酶的应用现状剪接型剪切型第一节结束点击返回第二节DNA(脱氧)核酶一、DNA核酶概念及其结构二、DNA核酶的催化特性三、DNA核酶的反应动力学特征四、DNA核酶的生物学意义一、DNA核酶概念及其结构概念具有酶活性的DNA分子称为脱氧核酶(deoxyribozyme或DNAzyme)RYRRNAsubstrate切割点R=AorGY=CorUdeoxyribozyme53一、DNA核酶概念及其结构结构Santoro和Joyce等通过体外选择技术提出了一种通用于RNA切割的脱氧核酶分子：10-23型一、DNA核酶概念及其结构结构Carmi等通过体外选择技术合成了一种依赖Ca2+的具有自我切割功能的手枪型二级结构脱氧核酶分子茎II(催化部位)茎I(结合部位)5’3’CA切割点10203040二、DNA核酶的催化特性1、催化效率高2、高度专一性3、活性依赖金属离子4、其它辅助因子三、酶促反应动力学特征1、pH值和温度对酶反应速率的影响DNA核酶PS5.M在pH4-8内，反应速率随pH上升而增大，在pH6.2左右达最大值，随后下降；最适温度在40℃左右2、激活剂金属离子：K+、Na+、Mg2+、Mn2+等；组氨酸；H+等3、酶浓度对酶反应速率的影响符合米氏方程，具酶催化特性RYRRNAsubstrate切割点R=AorGY=CorUdeoxyribozyme53四、生物学意义三种脱氧核酶的活性：连接酶活性金属螯合酶活性磷酸酯酶活性研究生命起源第二节结束概念及其结构催化特性反应动力学特征生物学意义催化效率高高度专一性活性依赖金属离子其它辅助因子pH值和温度对酶反应速率的影响激活剂酶浓度对酶反应速率的影响第二节结束点击返回第三节抗体酶一、抗体酶概述二、抗体酶的催化反应三、抗体酶的制备方法四、抗体酶研究展望一、抗体酶概述概念•是一种具有催化功能的免疫球蛋白(抗体分子)，在其可变区赋予了酶的属性，属于化学人工酶酶与抗体的差别酶是能与反应过渡态选择结合的催化性物质，抗体是和基态分子结合的非催化性物质二、抗体酶的催化反应1、酰基转移反应二、抗体酶的催化反应2、重排反应二、抗体酶的催化反应3、氧化还原反应二、抗体酶的催化反应4、金属螯和合反应二、抗体酶的催化反应5、磷酸酯水解反应二、抗体酶的催化反应6、磷酸酯闭环反应二、抗体酶的催化反应7、光诱导反应a.光聚合反应（二聚作用）二、抗体酶的催化反应7、光诱导反应b.光裂解反应三、抗体酶的制备方法1、拷贝法2、引入法1、拷贝法用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，获得具有原来酶活性的抗体酶缺点：具有一定的盲目性和偶然性，并且不能产生新酶2、引入法将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结合部位，可采用选择性化学修饰方法，亦可利用蛋白质工程和基因工程技术四、抗体酶研究展望研究酶作用机理，获得蛋白质结构与功能间关系的一般规律获得一类新型的蛋白酶催化天然酶不能催化的反应第三节结束抗体酶概述抗体酶的催化反应抗体酶的制备方法抗体酶研究展望酰基转移反应重排反应氧化还原反应金属螯和合反应磷酸酯水解反应磷酸酯闭环反应光诱导反应拷贝法引入法第三节结束点击返回Ⅰ型内含子的剪接机制pG-OHp3’pP-GOHpP-G3’HOMg2+或Mn2+GMP,GDP,GTP外显子内含子或居间序列（Interveningsequence,IVS)5’IVSL-19IVSUCUAAAGUAAPre-rRNAUCUAAAGUAAUCUoH3’5’GAAAGUAAUCUUAA5’GAAAGOH3’G-IVS19nt5’3’rRNA5’3’5’pGOH3’5’3’四膜虫rRNA前体自我剪接反应Ⅰ型内含子二级结构通式保守序列G结合位点剪接部位引导序列Ⅱ型内含子的剪接机制p2’HO-App-Ap3’OHpP-AHO3’Mg2+套环的形成5’3’外显子连接Ⅱ类内含子有一个保守的二级结构：结构域Ⅰ：两个保守内含子结构序列EBS1,EBS2与两个外显子结构序列IBS1,IBS2互相配对结构域Ⅴ：高度保守，催化活性必需结构域Ⅵ：A提供2’-OHⅡ型内含子二级结构通式5’3’这类RNA进行自身催化的反应是只切不接。特点：在Mg2+或其他二价金属离子存在下，在特定的位点，自我剪切，产生5’-OH和2’，3’-环磷酸二酯末端。剪切机制核酶自身剪切反应锤头型核酶的二级结构和空间立体结构示意图三个双螺旋区13个核苷酸残基保守序列剪切反应在右上方GUX序列的3’端自动发生催化过程需要二价金属离子参与17位（X）的核苷酸残基多数是C,不能是U,G.7位核苷酸残基的置换不会对酶活性产生很大影响锤头二级结构编号7位核苷酸17位核苷酸锤头结构的五种类型R示酶，S示底物，箭头示剪切位点发夹（hairpin）结构•发夹核酶发现于三种不同植物RNA病毒，即烟草环点病毒，菊苣黄色斑点病毒型和筷子芥花叶病毒。三种发夹核酶分别是这些RNA病毒卫星RNA的负链，英文缩写分别是sTRSV,sCYMVT,sARMV,均为单链RNA•发夹核酶催化机制金属离子在催化反应中起结构作用，其剪切活性比锤头结构核酶高5个环和4个螺旋形成两个结构域剪切反应发生在底物识别序列GUC的5’端两个内部环中的碱基及在螺旋区Ⅱ的G11和底物中的G+1都是酶发挥作用所必需的5‘3‘发夹二级结构模型剪切位点HDVRNA斧头结构模式三个碱基对的茎需要二价阳离子，产生5’-OH和2’,3’-环磷酸剪切部位剪切部位GUACGGCCGGUGCCGGCUGGGGCAUUCCGAGGGGACCAAGUAAUGGCUCCCCUGcCGGGUCCAGCCUUCCGCCUCAGGUAAGCG3’5’剪切位点HDV核酶假结样结构ⅠⅡⅢⅣL3L4J1/2J1/4J2/4四个螺旋区，三个连接区，两个环活性中心区：J1/4,J2/4,L3剪切位点：688/689