酒精性肝损伤造模

探索性医学综合实验—教学改革与实践（第五期）44酒后饮绿茶对小鼠肾功能影响的实验性研究李佳陈路军陈洁徐立思齐慧娟陆妙君指导老师：黄品贤（上海中医药大学03中西（七）上海201203）[摘要]目的观察给最佳酒醉状态的小白鼠灌茶对肾功能的影响。方法检测给小白鼠0.15ml/10g白酒后20min灌入低、中、高浓度茶、解酒阳性对照药枳椇子各0.20ml/10g，连续7天后血肌酐、血尿素蛋及尿蛋白含量。结果⒈高中浓度茶组、模型组的尿蛋白与正常组相比有显著差异，P0.05。⒉各组生存曲线比较的Log-rank检验结果：χ2=20.39，P0.01。⒊肾脏病理改变：低浓度茶组小鼠肾小球、肾小管未见明显病变，但间质血管扩张充血明显，有较多量红细胞漏出，可见炎症反应，间质未见纤维化；中浓度茶组肾组织结构完整，肾小球、肾小管未见明显病理变化，间质未见明显充血，少量红细胞漏出，间质未见纤维化；高浓度茶组肾脏组织结构与中浓度茶组接近。阳性对照组肾组织结构基本完整，肾小球、肾小管未见明显病理变化，间质少量充血。结论根据尿蛋白、实验小鼠的生存曲线分析、肾脏的病理结果的一致性得出：⒈酒后饮茶均可导致小鼠的死亡，但是酒后高浓茶对肾脏的损害作用最小。⒉酒后饮淡茶及阳性解酒药枳椇子能起到一定解酒作用，但对肾脏有明显的损害。但本次实验由于死亡率高致样本含量不够，确切的结论有待继续研究。[关键词]酒，茶，小白鼠，肾功能，病理学在中国，茶能解酒是自古以来就流传的说法。日常生活中，人们通常用绿茶来帮助消食解酒，且认为茶越浓解酒效果越好。人们认为，饮茶能够使人大脑兴奋、清醒，酒后饮茶能够让被酒精冲昏了的头脑清醒一些，从而达到“醒酒”的效果。但近年来，有越来越多的报道指出：过量饮酒后饮茶对肾脏有害无益。其理论依据为：绿茶的主要成分茶碱有利尿作用，浓茶中的大量茶碱更能迅速发挥利尿作用，促使尚未分解的酒精代谢产物——乙醛过早地进入肾脏，而乙醛对泌尿系统有很大的损害作用。本实验采用56度白酒以最佳致醉量对小鼠灌胃后，用等量不同浓度的绿茶及阳性对照药物枳椇子对醉酒小鼠进行灌胃的方法，通过检测鼠尿中的尿蛋白、血样中血肌酐、尿素氮指标及对肾脏组织病理切片的观察，对以上两种观点的正确性作出验证。现将实验研究结果报告如下。1材料与方法1.1实验动物：昆明种小鼠120只，体重：20-35g，雌雄各半，由上海中医药大学动物实验中心提供。动物房饲养温度：20-23℃，相对湿度：50-70％，标准饮食，饮自来水。1.2实验仪器和试剂及其制备：1.2.1实验仪器：针筒灌胃针、天平、试剂瓶、代谢笼、离心机、气象色谱仪、生化分析探索性医学综合实验—教学改革与实践（第五期）45仪等。1.2.2实验试剂及其制备：1.2.2.156度红星二锅头：北京红星酿酒总厂生产。1.2.2.2绿茶：黄山毛峰（一级，散装）。绿茶制备：低浓度茶：10g绿茶加入100度蒸馏水1000ml，浸泡30分钟，用两层纱布过滤；中浓度茶：25g绿茶加入100度蒸馏水1000ml，浸泡30分钟，用两层纱布过滤；高浓度茶：40g绿茶加入100度蒸馏水1000ml，浸泡30分钟，用两层纱布过滤。1.2.2.3枳椇子：由张江孙桥饮片厂提供。枳椇子水煎剂制备：枳椇子25g，加200ml水煎煮1.5小时，纱布过滤，滤渣加200ml水煎煮1小时，过滤，两次滤液合并。提取液含生药62.5mg/ml。[1-4]1.2.2.4尿蛋白测定试剂盒（考马斯亮蓝法）；尿素氮试剂盒-BUN(OPA法)；肌酐试剂盒-CRE(苦味酸不除蛋白法)。1.3实验方法：1.3.1预实验：以0.25ml/20g，0.30ml/20g，0.35ml/20g56度红星二锅头分别对三组小鼠进行灌胃，每组5只。观察令小鼠出现翻正反射消失而无小鼠死亡的所需酒量。找出最佳致醉量为0.30ml/20g。[5-6]1.3.2动物分组：称重后，按体重将105只小鼠随机分为6组，空白对照组、模型组、枳椇子组，每组17只；低浓度茶、中浓度茶、高浓度茶组，每组各18只。每日11点开始灌胃，连续7天。1.3.3给药量见下表1。表1酒后饮绿茶给药量方法组别第一次灌（0.15ml/10g）20min后再灌空白组0.9％生理盐水0.9％生理盐水0.2ml/10g造模组白酒0.9％生理盐水0.2ml/10g枳椇子组白酒枳椇子水煎剂0.2ml/10g高浓度茶组白酒高浓度茶0.2ml/10g中浓度茶组白酒中浓度茶0.2ml/10g低浓度茶组白酒低浓度茶0.2ml/10g注：每日灌白酒的量相当于成人每天饮用三两酒的量。1.4生化检测及病理检查第8天以小鼠代谢笼法搜集尿样，并断头取血，取肾脏。样品由上海中医药大学附属曙光医院检验科检测生化指标：尿蛋白、血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）；由曙光医院病理实验室制作病理切片。1.5统计方法：计量资料以均数±标准差表示；计数资料用百分率表示。资料经正态性检验和方差齐性检验后，再进行方差分析和LSD检验；以及采用Log-rank检验，用SPSS12.0统计软件探索性医学综合实验—教学改革与实践（第五期）46处理。2结果2.1.各组小鼠实验中的死亡情況和各组生存曲线比较的Log-rank检验。见表2。表2各组小鼠实验中的死亡情況组别实验前第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天死亡率(%)正常组17001100011.7模型组17310100135.3阳性对照组17423101170.5高浓度茶组18611002372.2中浓度茶组18722020072.2低浓度茶组18342111172.2合计10523109434656.2注:各组间有显著差异:P0.05.表3各组生存曲线比较的Log-rank检验结果组别n平均生存时间（天）95%可信区间生存率(%)正常组176.596.05～7.1388.24图1各组动物的死亡率比较11.735.370.572.272.272.201020304050607080正常组模型组枳椇子组高浓度茶组中浓度茶组低浓度茶组死亡率（%）探索性医学综合实验—教学改革与实践（第五期）47模型组175.474.19～6.7564.71阳性对照组174.223.01～5.4333.33高浓度茶组184.393.07～5.7127.78中浓度茶组183.442.22～4.6127.78低浓度茶组184.112.96～5.2727.78合计10544.34Log-rank检验结果：χ2=20.39，df=5，P=0.0011。图2各组动物生存曲线的比较2.2各组小鼠尿液中尿蛋白含量比较见表4。表4各组小鼠尿液中尿蛋白含量比较（μmol/l）组别ｎ尿蛋白正常组51.32±0.51#模型组50.73±0.17*枳椇子组51.01±0.39高浓度茶组50.72±0.27*中浓度茶组50.640±.13*低浓度茶组51.320±.65#合计300.950±.39注：*表示与正常组比较ｐ0.05；#表示与模型组比较ｐ0.05SX正常組模型组枳椇子组高浓度茶组中浓度茶组低浓度茶组探索性医学综合实验—教学改革与实践（第五期）482.3各组小鼠血肌酐（Cr）含量比较见表5表5各组血肌酐的比较(umol/L)组别nCr正常组434.2527.96模型组217.50±0.71枳椇子组00.00±0.00高浓度茶组427.751±2.84中浓度茶组00.00±0.00低浓度茶组220.50±0.71合计1227.001±7.37注：n为0，说明该组小鼠血肌酐值不在测定范围，没有测出来。根据专业知识得到血肌酐应该是服从正态分布的资料，但是，本次试验有的组别因未能测到血肌酐，同时，各组样本量比较少，而且个体差异也比较大，经方差分析得出各组间无显著差异。仅作参考。2.4肾脏病理切片结果：正常小鼠肾组织（10×10）低倍镜下肾组织结构完整，肾小球、肾小管未见异常，间质血管可见正常小鼠肾组织（10×40）高倍镜下肾小球、肾小管结构基本正常，间质未见炎性充血低浓度茶组小鼠肾组织图（10×10）低倍镜下肾小球、肾小管未见明显病变、但SX探索性医学综合实验—教学改革与实践（第五期）49间质血管扩张充血明显低浓度茶组小鼠肾组织图（10×40）高倍镜下见肾小球有较多量红细胞漏出，肾小管上皮未见水肿、间质血管扩张充血较明显，可见有炎症反应，但间质未见纤维化中浓度茶组小鼠肾组织图（10×10）低倍镜下肾组织结构完整，肾小球、肾小管未见明显病理变化，间质未见明显充中浓度茶组小鼠肾组织图（10×40）高倍镜下见肾小球有少量红细胞漏出，肾小管未见明显病变、间质血管少量充血，未见纤维化。高浓度茶组小鼠肾组织图（10×10）与中浓度茶组类似，未见明显差异高浓度茶组小鼠肾组织图（10×40）与中浓度茶组类似，未见明显差异探索性医学综合实验—教学改革与实践（第五期）50枳椇子组小鼠肾组织图（10×10）低倍镜下肾组织结构基本完整，肾小球、肾小管未见明显病理变化，间质少量充血枳椇子组小鼠肾组织图（10×40）高倍镜下见肾小球有少量红细胞漏出、间质血管未见明显充血，间质未见纤维化模型组小鼠肾组织图（10×10）低倍镜下肾小球、肾小管未见明显病变、但间质血管扩张充血较明显模型组小鼠肾组织图（10×40）高倍镜下见肾小球有较多量红细胞漏出，间质血管扩张充血较明显，可见有炎症反应，间质未见纤维化（7）2.5饮酒人群流行病学问卷调查结果：调查总人数138人，喝酒人135人。喝酒人群中用茶来解酒的有52人，占38.52%。知道茶能解酒的有46人，占喝酒人群的34.07%，其他解酒方式有催吐、吃水果、解酒药、吃饭、睡觉、喝饮料、休息，其中，催吐13.04%；吃水果解酒18.12%；解酒药5.80%；其他28.99%。真正了解饮酒后用茶解酒是否对肾脏有损伤的人为0%。3讨论3.1从各组小鼠实验中的死亡情况来分析：实验的前4天，小白鼠死亡率较高，可能与其体质有关，个体差异较大，实验动物选择小鼠，生命力较脆弱，对高度酒精的耐受能力较差。空白组的死亡率又明显低于其他各组，也与所给药物对小鼠的作用有关。通过各组生存曲线比较的Log-rank检验结果可说明各组的生存曲线有显著的差异，饮酒后无论饮高、中、低浓度的茶，都可导致小鼠的死亡，尤其是中浓度组的平均生存时间低于其他任何组别，其次是低浓度组。这说明酒后饮中、低浓度的茶对小鼠的健康很不利，而高浓度茶组的生存时间相对于中、低浓度组较长一些，这一结果与病理切片所得结果的判断是一致的。在造模方面，我们查到的文献中，小鼠多用于做酒精中毒的急性实验，其实验周期多为1-3天，大鼠多用于做慢性酒精毒理实验，实验周期多为1-4个月。我们的实验周期为八天，介于两者之间，由于实验时间及经费的限制条件，我们选择小鼠造模，而小鼠耐受酒精的能力较差是本实验中死亡率高的重要原因。探索性医学综合实验—教学改革与实践（第五期）513.2由尿蛋白按检测结果得出：正常组与阳性组、低浓度组无差别；中、高浓度组，造模组低于正常组。根据这一结果，可推测：⒈适量饮酒有助于降低蛋白在肾脏的滤过率，酒后饮用浓茶，此效应更显著；⒉低浓度茶与枳椇子一样，具解酒的功效，中、高浓度茶无；⒊饮酒及酒后饮中、高浓度茶有利尿作用，但小便清长，排出的杂质减少（由尿蛋白及尿量推测，尚需实验进一步证明）。3.3按病理切片结果得出：饮低浓度茶和解酒的枳椇子水煎剂对肾脏有害无益，我们推测其损伤机制如下：酒精首先在肝脏内进行代谢，在氧化酶的作用下先是被氧化为乙醛，进而被氧化为乙酸，乙酸又可进一步被氧化为二氧化碳和水，再分别经肾和肺排出。茶的主要成分茶碱有利尿作用，大量茶碱更能迅速发挥利尿作用，促使尚未分解的乙醛过早地进入肾脏，而乙醛对泌尿系统有很大的损害作用。有关报道指出，茶中的有效成分茶多酚确实可以用于治疗慢性肾脏的疾病。[8-9]我们推测：中高浓度茶中的茶多酚含量较多，能有效的保护肾脏使其受到损伤的程度降低，但没有很好地解酒功效。但由于实验周期短，各组小鼠肾脏均未出现纤维化。3.4结论根据尿蛋白、实验小鼠的生存曲线分析、肾脏的病理结果