基因分型技术

个体化分子诊断的检测技术个体化诊断的内容个体化诊断的技术简介技术原理提纲年龄老年人儿童新生儿性别身高/体重并发症病程什么是个体化分子诊断脏器功能肝,肾,心环境因素饮食/吸烟/合并用药药物反应个体差异基因个体化基因检测方向突变（mutation）表达水平（levelofexpression)甲基化修饰（methylation)基因突变检测技术测序；探针；质谱；基因突变检测技术测序探针质谱原始信号光光光一级信息探针结合分子量二级信息序列是否改变分子大小是否改变……推论推论最终信息碱基序列是否改变PPiATPLightlighttimeSignalPyrosequencing-ChemistryReagentcartridge(Inkjetdelivery)CCDcameradetectionX-Ydrivepositioning24wellplatemix&thermostatLensarrayQ24InstrumentDesign焦磷酸测序的原理AGGATCT?????????CTTCCAGAT准确度决定临床判断的价值45%EESSGGTTCCTTGG5TTCCGGTTAA10GGTTCCGGCC15TTGGAATTCC20GGTTAAGGTT25CCGGAA0200400600800100012001400Sequencetoanalyze:YGYGGTGYGTATYGTTTGYGATDispensationOrder:48%47%45%45%探针技术的常见应用ARMs液相芯片基因芯片荧光PCR引物数量2222探针SybGreen引物固定于磁珠的探针固定于玻片探针荧光探针信号捕捉CCDCCD扫描仪或肉眼CCD判读光信号的有无探针技术——Taqman野生型的序列为TTGTGGTAGTTGGAGCTGG12ASP突变型（ARMS）引物P1TTGTGGTAGTTGGAGCTGA12ASP突变型（ARMS）引物P2TTGTGGTAGTTGGAGCTCA12ASP突变型（ARMS）引物P3TTGTGGTAGTTGGAGCAGA探针法的案例——ARMS图13条ARMS引物的扩增曲线（模板为3*108copies/ul野生型质粒）图23条ARMS引物的扩增曲线（模板为3*108copies/ul突变型质粒）基因突变检测技术对比性能测序技术探针DHPLC荧光PCR基因芯片悬液芯片ARMS检测通量高低高高低高灵敏、准确度高高一般高一般高重复性好好一般好好好可否定量是否是是否否技术可靠性金标准/////基因突变检测技术对比金标准（Goldenstandard）在检测中的作用：现有技术所能达到的最先进水平，最接近客观事实，或者反映的就是客观事实本身；如同病理诊断；为什么测序是金标准？人类基因组计划（humangenomeproject,HGP）；1990年正式启动人类基因组测序计划,2003年完成。识别人类基因组的所有大约3万个DNA测定组成人类基因组DNA的约30亿对核苷酸的序列测序应用的新高度对定性检测（Qualitativetest）进行定量分析（QuantitativeTest）；突变定量检测的必要性突变负荷（mutationalload）；疾病不同阶段（stageofdisease）；对应的策略不同；准确度高灵敏度高相对定量判读焦磷酸测序的优点检测下限影响临床判断可检测3%的突变野生型突变型302060501010040908070基因所占比例灵敏度：3%灵敏度：30%检测方法敏感度影响临床判断PCR扩增PCRamplification～2h基因突变检测流程Pyrosequencing测序样本准备Samplepreparation～15minDNA提取DNApurification～2hPyro测序Pyrosequencing～10-100min结果分析Genotypingandidentification收取样本：血样或组织基因表达水平的检测检测mRNA的水平；基因表达水平的检测技术mRNA的降解；20℃时，Y=0.62-0.004X（R=-0.981，P0.001）；15℃时，Y=0.965-0.001X（R=-0.709，P0.001）；Y：18sRNA含量X：离体时间对标本位置的要求；mRNA表达水平是相对定量mRNA差异表达的相对定量分析两种相对定量的分析方法：双标准曲线法和Delta-deltaCt法。基因修饰的检测DNA甲基化修饰：基因甲基化的检测意义基因甲基化检测的意义目前肿瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。这是因为人们发现肿瘤的发生与抑癌基因启动子区的CpG岛甲基化造成抑癌基因关闭非常可能有关。甲基化的诊断可以用于肿瘤发生的早期预测肿瘤的分级甚至可以作为患病风险预测、临床病程监控和疗效评估的指标。焦磷酸检测基因甲基化甲基化程度的量化无法定量的甲基化检测