凝胶层析

LOGO凝胶层析法LOGO目录应用及实例分析影响因素操作步骤凝胶的种类和性质概述一五四三二LOGO定义概述凝胶层析是以各种多孔性凝胶填料为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种技术。LOGO凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。原理概述凝胶层析过程示意图LOGO1345操作简便，所需设备简单分离效果较好，条件缓和重复性高，节约能源应用广泛分辨率不高，分离操作较慢凝胶层析特点概述2LOGO层析介质特点遇水为不溶解的固相化学惰性物质离子基团含量少颗粒大小和网眼均匀机械强度较强具有可选择的多种孔径凝胶的种类和性质LOGOTextText葡聚糖凝胶（Sephadex）聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP）琼脂糖类凝胶（Sepharose）修饰葡聚糖凝胶（ModifiedSephadex）多孔玻璃微球（Bio-glas）疏水性凝胶（hydrophobicgels）典型其它凝胶的种类和性质LOGO凝胶的种类和性质1.葡聚糖凝胶(Sephadex)商品名为SephadexG：G后的数字为凝胶吸水值的10倍。G反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大。型号（G-X）分离范围（分子量Da）适用范围G10-G25700-5,000脱盐、小肽等G501,500-30,000低分子量蛋白、多肽G-753,000-70,000中、低分子量蛋白、多肽G-1004,000-150,000中、高分子量蛋白G150-G2005,000-800,000高分子量蛋白LOGO1、稳定工作pH为2－10，在水、盐、碱、弱酸以及有机溶液中都比较稳定。2、在高温下稳定，可煮沸消毒。3、有多种颗粒大小可以选择。4、呈弱酸性，有时与分离物中的一些带电基团发生吸附作用。5、机械稳定性相对较差。凝胶的种类和性质葡聚糖凝胶的特点LOGO凝胶的种类和性质2.聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP）商品名为生物凝胶-P（Bio-GelP）。一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。特点：1、通过控制交联剂用量可制成各种型号凝胶；2、稳定性好、强度高；3、保存方便。LOGO依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。凝胶的种类和性质3.琼脂糖凝胶（Sepharose;pharmacia;Bio-Gel(Blo-Rad)琼脂糖凝胶（agarosegel）可以分离葡聚糖凝胶和生物胶所不能分离的大分子，使凝胶层析的分离区间扩大到大分子和病毒颗粒，其最大范围可达相对分子质量108。其稳定性远不如葡聚糖凝胶和生物胶P，强酸强碱能引起结构破坏。最佳使用条件为pH4～9之间，温度0～40℃。LOGO1.分离范围大，无共价键的交联；2.孔径取决于琼脂糖浓度；3.颗粒强度差，化学稳定性差。凝胶的种类和性质琼脂糖凝胶做成珠状后不再脱水干燥，否则不能再溶胀恢复原有形状，因此商品大都以含水状态供应，并应在湿态保存。一般悬浮在l0-3mo1/LEDTA和0.02%叠氮化钠溶液中。琼脂糖凝胶的特点LOGO1操作步骤凝胶的预处理（1）凝胶在使用前必须在过量的溶剂中充分膨胀，否则影响层析的均一性，甚至使柱破裂，自然溶解需24小时以上，加热至沸需2小时即可。（2）用倾斜法除去混杂的小颗粒，重复2-3次。装柱是凝胶层析中最重要的一步操作。（1）将柱垂直安装好；（2）在柱内先装入1/5的水，用玻棒搅拌凝胶，沿玻棒倒下，待凝胶开始沉降时，打开出口。凝胶床必须装得均匀，尽量一次装完，以免出现不均匀的凝胶带，因此，在装柱时需打开下口，并调节适当的流速。（3）连接恒压洗脱瓶，平衡流速，开始流速不能太大，应低于层析时所需的流速。（4）经平衡后的凝胶床顶部留下1ml左右的液体。关闭出口管上的螺旋夹。2凝胶的填装LOGO操作步骤吸取样品溶液，加到凝胶床的表面上，不要沿柱壁加样品，注意加样时勿将柱床冲起。打开出口，使样品恰好进入床面(不要让空气进入床内)，用上法滴加1-2倍样品体积的蒸馏水。待样品完全流进床内后，再加蒸馏水进行扩展洗脱，控制流速，直至两条区带分开为止。绘制洗脱曲线：以光密度为纵座标，以时间为横座标，并标明洗脱峰的名称。3样品的加入4洗脱5比色测定6凝胶的回收LOGO凝胶用过后的保存方法湿态保存干燥保存半收缩保存在水相中加防腐剂，或水洗到中性，高压灭菌封存（或低温存放）水洗后滤干，加70％乙醇使胶收缩，再浸泡于70％乙醇中保存水洗后滤干，依次用50％、70％、90％、95％乙醇脱水，再用乙醚洗去乙醇，干燥(或60～80℃烘干）后保存。加乙醇时，切忌一上来就用浓乙醇处理，以防结块。操作步骤LOGO1层析柱的选择与填充加样量421层析柱的大小应根据分离样品量的多少及对分辨率的要求而定。凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无汽泡。影响凝胶层析的因素流速一般控制流速在30-200ml/小时。加样量的多少应根据具体的实验而定：一般分级分离时加样量约为凝胶柱床体积的1％－5％，而分组分离时加样量约为凝胶柱床体积的10%-25%.其选择主要取决于待分离样品，一般来说只要能溶解洗脱物质，并不使其变性的缓冲液都可用于凝胶层析。13洗脱液LOGO凝胶层析的应用本法脱盐操作简便、方便。脱盐用的凝胶多为凝胶颗粒强度好、流速快的高交联度凝胶。为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。应用已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。（1）求解法:（两个已知分子量的蛋白质过柱）Vel=C－KlogM1Ve2=C－KlogM2（2）标准曲线法:（先以3个以上已知分子量的标准蛋白过柱）:标准曲线法准确性较高。通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液。凝胶层析的应用分离提纯脱盐分子量测定高分子物质浓缩LOGO应用实例通过SephadexG-50层析柱，以蒸馏水为洗脱剂，分离血红蛋白(红色，分子量约64500)与硫酸铜(蓝色，分子量249.5)的混合物，从颜色的不同观察血红蛋白和硫酸铜的洗脱速度。实验1、凝胶层析法分离蛋白质一．材料1．仪器层析柱(直径0.8-1.5cm，长10-20cm)；吸管；玻璃棒；小烧杯；25ml量筒；试管。2．试剂SephadexG-50；抗凝血；0.9%NaCI溶液；硫酸铜溶液二．方法（一）凝胶的准备。（二）样品制备1．血红蛋白(Hb)溶液的制备取抗凝血液约0.5ml于离心管中，离心5分钟(2500rpm)，弃去上层血浆，用0.9%NaCI溶液3ml洗血细胞二次，将血细胞用1.5ml蒸馏水稀释，即为Hb稀释液，备用。2．取Hb稀释液与CuSO4溶液各0.5ml，充分混匀，此混合液作为样品。LOGO（三）装柱层析柱(直径0.8-1.5cm，长度20cm)（四）加样与洗脱注意事项：洗脱的过程中，应不断滴加蒸馏水，使始终凝胶床的上表面保留约2cm左右的蒸馏水应用实例LOGO采用三种不同尺寸的色谱柱比较纳米粒洗脱行为，选出最优过柱条件，最后进行包封率的测定。一．材料1．仪器内径1.9cm，1.5cm，柱高10cm的色谱柱；吸管；玻璃棒；小烧杯；25ml量筒；试管。2．试剂SephadexG-25、G-50、G-100；地塞米松纳米粒；蒸馏水二．方法根据实验室常用待分离纳米粒的数量考察相应规格的色谱柱:柱内径分别为1.9cm，1.5cm，柱高10cm，以地塞米松原料药经洗脱液溶解，稀释至一定浓度，取一定体积上样，测定洗脱液中的药物浓度。经预实验、单因素考察等实验选出最优过柱条件。取3批地塞米松纳米粒，各取0.5ml，以优化后的条件过柱，以混合液洗脱，接取白色胶体洗脱液，依法测定，计算纳米粒分离比即包封率。实验2、葡聚糖凝胶色谱法测定纳米粒包封率应用实例LOGO