凝胶层析法

第七章凝胶层析（色谱）（Gelchromatography）1凝胶层析（gelchromatography）也称：分子筛层析分子排阻层析凝胶过滤凝胶色谱等是指混合物随流动相经过凝胶层析柱时，由于各组分流经体积的差异，使不同分子量的组分得以分离的层析方法。简介凝胶色谱是以各种多孔性凝胶填料为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种技术。突出优点是：凝胶不带电荷、吸附力弱、不需再生处理可反复使用、操作条件温和、对分离成分不变性和破坏、对高分子物质有很好的分离效果。4第一节凝胶层析的基本原理凝胶层析的分离过程是在装有多孔物质填料的柱中进行的。柱的总体积为VA，它包括填料的骨架体积VGM，填料的孔体积Vi(内水体积)以及填料颗粒之间的体积V0（外水体积）。VA=Vi+V0+VGM1、外水体积：指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，即凝胶颗粒间液体流动相的体积。（用Vo表示）2、内水体积：指凝胶颗粒中孔穴的体积，即凝胶层析中固定相体积。（用Vi表示）3、骨架体积：指凝胶颗粒实际骨架体积。（用VGM表示）4、柱的总体积：指凝胶柱所能容纳的总体积。（用VA表示）5、洗脱体积：指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。（用Ve表示）则：Vt=Vo+Vi+Vg流动相体积固定相体积总体积78原理当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较小的分子在柱中停留时间比大分子停留的时间要长，于是样品各组分即按分子大小顺序而分开，最先淋出的是最大的分子。Ve=V0+ViKd1、比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；2、较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；3、分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间。也叫凝胶过滤层析凝胶过滤层析过程示意图小分子大分子凝胶基质凝胶珠分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。13（一）平衡排除理论当溶质层流过一个填料颗料这段距离时，溶质分子已多次进出于填料的孔，达到平衡。平衡条件只是在流速很慢时的一个极端情况。14（二）扩散分离理论溶质分子在流经色谱柱的过程中，在流动相和固定相之间没有达到平衡，存在着流速依赖性。聚苯乙烯和苯乙烯样品淋出曲线的流速依赖性1．流速为0.65ml/min；2．流速为2.0ml/min溶剂为甲苯15（三）流动分离理论红细胞在毛血细管中流动时比血浆流得快。较大的分子较先通过或绕过这个填料颗粒，使溶质能按其大小进行分离。16分离过程三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的凝胶柱进行分离。样品加入，以水或其他溶液进行洗脱，即得洗脱曲线。17分离过程最先流出物质A，A分子量最大，完全不能进入颗粒内部，只能从颗粒间隙流过，“全排阻”。其流经体积最小，等于外水体积V0。最后流出物质C，它分子量最小，其分子可以自由进出凝胶颗粒，“全渗入”。流经体积是外水体积与内水体积之和V0+Vi。物质B分子量介于渗入限与排阻限之间，其分子能够部分地进入凝胶颗粒中。“部分排阻”或“部分渗入”。流径体积Ve是全部外水体积加上内水体积的一部分，即Ve=V0+KdVi18分配系数Kd排阻系数：当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。0＜Kd＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。19物质的Kd值20凝胶层析的特点（1）凝胶层析操作简便，所需设备简单。（2）分离效果较好，重复性高。（3）分离条件缓和。（4）应用广泛。（5）分辨率不高，分离操作较慢。21第二节凝胶的结构和性质一、葡聚糖凝胶(Sephadex)二、修饰葡聚糖凝胶(ModifiedSephadex)三、聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP）四、琼脂糖类凝胶（Sepharose）五、多孔玻璃微球(Bio-glas)六、疏水性凝胶（hydrophobicgels）22一、葡聚糖凝胶(Sephadex)商品名为SephadexG类。交联葡聚糖的基本骨架是葡聚糖。再经3-氯-1，2-环氧丙烷为交联剂，形成三维网状结构的高分子化合物。其交联度是通过交联剂的加量及反应条件来控制的。交联葡聚糖凝胶的化学结构葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大。G类葡聚糖凝胶常用G-X代表，X数字既代表交联度，也代表特水量。X数字越小，交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子质量生化产品。X数字越大，交联度越小，网孔越大，适用于分离高分子生化产品。X数字也代表凝胶的持水量，如G-25表示1g干胶持水2.5mL，G-100表示1g干胶持水10mL，依次类推。25SephadexG编号意义：1、吸液量；2、溶涨时间；3、凝胶孔径；4、分离范围蛋白质、多糖26葡聚糖凝胶性能与编号的关系编号交联度吸液量膨胀速度凝胶孔径分离限凝胶强度大（SephadexG－150）小大慢大大小小（SephadexG－50）大小快小小大27葡聚糖凝胶（G类）的规格28葡聚糖凝胶（G类）特点1、孔径。2、稳定性。3、吸附作用。4、芳香族化合物和杂环化合物。1、Sephadex在水、盐、碱、弱酸以及有机溶液中都比较稳定，可以多次重复使用。2、稳定工作pH为2－10，强酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂。3、在高温下稳定，可煮沸消毒，在100°C下40min对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。性质与特点4、含有羟基，呈弱酸性，有可能与分离物中的一些带电基团（尤其是碱性蛋白）发生吸附作用。但一般在离子强度大于0.05的条件下，几乎没有吸附作用。5、有各种颗粒大小（粗、中、细、超细）可以选择，一般粗颗粒流速快，但分辨率较差；细颗粒流速慢，但分辨率高。6、机械稳定性相对较差，不耐压，分辨率高的细颗粒要求流速较慢，所以不能实现快速而高效的分离。31保存保存的方法有干法、湿法和半缩法三种。湿法：加入一定量的防腐剂置于冰箱中作短期保存（6个月以内）。常用0.02%叠氮化钠、0.02%三氯叔丁醇、20%乙醇等。干法：用浓度逐渐升高的乙醇分步处理洗净的凝胶，脱水收缩，抽滤，用60~80℃吹干。半缩法：32二、修饰葡聚糖凝胶(ModifiedSephadex)（一）亲脂性葡聚糖凝胶（LipophilicSephadex）骨架结构上引入一些有机基团，如甲基、羟丙基，使呈亲脂性，同时保留亲水性。这种凝胶既亲脂又亲水，可在多种有机溶剂中膨胀。这种凝胶在pH＞2的不含氧化剂的溶液中稳定。用低级醇为溶剂时，对芳香族、杂环族化合物仍有吸附作用。但用氯仿时则可去除对上述化合物的吸附作用，而对含羟基与羧基的化合物却有吸附作用。国产SephadexLH－20可用于分子筛层析、吸附层析和分配层析。很适用于脂肪酸、甘油脂、类固醇、维生素、激素类生化产品的分离。洗脱剂可用单一有机溶剂如甲醇、氯仿等，也可用混合溶剂如氯仿与甲醇的混合液。（二）葡聚糖凝胶离子交换剂在G类凝胶上引入一些酸性或碱性基团后，则制得各种葡聚糖凝胶离子交换剂。如引入磺乙基（SE-Sephadex）、羧甲基（CM-Sephadex）及二乙胺基乙基（DEAE-SephadexA）等。葡聚糖凝胶离子交换剂具有离子交换和分子筛双重作用。其结构多孔、疏松、非特异性吸附很少，层析时流速易控制，特别适用于蛋白质、酶、激素、多核苷酸等的分离纯化，以及生化制剂的除热原。35交联葡聚糖离子交换剂36（三）Supperdex系凝胶由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成。（四）Sephacryl系凝胶是由烯丙烷基葡聚糖经甲叉双丙烯酰胺共价交联制成的。理化稳定性好，为硬性凝胶，可耐高压灭菌。37Supperdex系凝胶38Sephacryl系凝胶39三、聚丙烯酰胺凝胶商品名为生物凝胶-P（Bio-GelP）。该凝胶由丙烯酰胺组成；以亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，聚合而成。只要控制单体用量和交联剂的比例，就能得到不同型号的凝胶。特点：1、孔径；2、稳定性、强度；3、无非特异吸附，保存方便；4、编号反映出它的分离界限。在聚丙烯酰胺凝胶的合成过程中，单体和交联剂的配比可以任意改变。以（T）代表100mL凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克数，称为凝胶浓度。而其中交联剂占单体和交联剂总量的百分比称为交联度，以（C）表示，交联度越大，网孔越小，交联度越小，则网孔越大。聚丙烯酰胺凝胶全是由碳一碳骨架构成，稳定性较好，适合于做凝胶层析的载体。只有在极端pH条件下酰胺键才被水解为羧基，使凝胶带有一定的离子交换基团，故一般只在pH2～11的范围内使用。像Sephadex一样，商品聚丙烯酰胺为颗粒状的干粉，它有十分明显形成块状并粘附在一起的倾向，在溶剂中能自动溶胀成胶。根据聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范围的不同，可分成10种类型。各种类型均以英文字母P和阿拉伯数字表示，从Bio-GelP-2至Bio-Ge1P-300。P后面的阿拉伯数字乘以1000即相当于排阻限度（按球蛋白或肽计算）。目前，美国Bio-RadLaboratories生产并出售多种规格的Bio-GelP。42聚丙烯酰胺凝胶的性质生物凝胶的编号反映出它的分离界限。如Bio-GelP-100。43四、琼脂糖类凝胶（Sepharose）（一）琼脂糖凝胶结构是由β-D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖以α-1，3-和β-1，4-糖苷键相间连接而成的链状分子。Sepharose琼脂糖凝胶（agarosegel）可以分离葡聚糖凝胶和生物胶所不能分离的大分子，使凝胶层析的分离区间扩大到大分子和病毒颗粒，其最大范围可达相对分子质量108，但是由于琼脂有强烈的吸附作用，给使用造成了困难，后来，从琼脂中分离出两个组分，一个组分为带负电荷的琼脂果胶，含有磺酸基和羧基；另一组分叫琼脂糖，它不含有带电基团，其结构是有β-D-吡喃半乳糖和3，6脱水-L-吡喃半乳糖相结合的链状多糖。这种琼脂糖被用来进行凝胶层析，它既具有琼脂凝胶相同的分离区间，又没有吸附作用。但其稳定性远不如葡聚糖凝胶和生物胶P，强酸强碱能引起结构破坏。最好使用条件控制在pH4～9之间，温度0～40℃，超出此范围,可能被破坏。46琼脂糖凝胶特点：1、没有共价键的交联。2、孔径依赖于琼脂糖的浓度。3、琼脂糖凝胶的化学稳定性较差。4、非特异性吸附力低。5、分离范围大。6、颗粒强度差。琼脂糖的商品名称有:Sepharose(瑞典)Bio-gelA(美国)Segavac(英国)Gelarose(丹麦)等多种，因生产厂家不同名称各异。琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶。它的商品名因生产厂家不同而异。瑞典的商品名称为Sepharose，有3种型号，即Sepharose2B，4B和6B（同中国相同）。阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分含量。美国的为Bio－GA，有6个型号，即Bio-G0.5M，1.5M，5M，15M，50M和150M。阿拉伯数字乘以106表示排阻限度。。英国的称为Sagavac，又分为Sagavac2F，4F，6F，8F，10F和2C，4C，6C，8C，10C。前面的阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分数，F代表粉末状，C代表颗粒状。丹麦的称为Gelarose，有5种类型，即2％，4％，6%，8％和10％。琼脂糖凝胶做成珠状后不再脱水干燥，否则不能再溶胀恢复原有形状，因此商品大都以含水状态供应，并应在湿态保存。一般悬浮在l0-3mo1/LEDTA和0.02%叠氮化钠溶液中。百分数表示干胶量。51琼脂糖凝胶分离范围琼脂糖凝胶有3个规格：Sepharose2B、4B、6B分别表示琼脂糖浓度为2%，4%，6%。52几种蛋白质Kav值53（二）架桥琼脂糖凝胶（SepharoseCL）架桥琼脂糖