第21章基因诊断与基因治疗

第二十一章基因诊断与基因治疗GeneticDiagnosisandGeneTherapy基因变异致病类型内源基因的变异基因结构突变基因表达异常外源基因的入侵第一节基因诊断概念和特点基因诊断的常用技术方法基因诊断的应用一、基因诊断的概念和特点概念利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。特点针对性强特异性高灵敏度高适用性强，诊断范围广二、基因诊断的常用技术方法核酸分子杂交技术1.限制性内切酶酶谱分析法2.DNA限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）分析3.等位基因特异寡核苷酸探针（allelespecificoligonucleotide，ASO）杂交法聚合酶链反应（PCR）基因测序基因芯片（一）核酸分子杂交技术•来源不同、具有互补碱基序列的核酸（DNA或RNA）单链在适宜条件下互补配对形成杂化双链结构。•选用已知顺序片段作为探针，经放射性同位素或非放射性物质标记后，再与未知的目的核酸链进行杂交反应。•分离已杂交和未杂交的标记核酸片段，通过标记信号的检测对未知的目的核酸链进行定性、定量分析。×MstⅡ酶切位点(GCTNAGG)5´3´正常基因5´3´突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析RLFP分析法3.等位基因特异寡核苷酸探针(allelespecificoligonucleotide,ASO)杂交法•当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成ASO用同位素或非同位素标记进行诊断。•探针通常为长20bp左右的核苷酸。•用于探测点突变时一般需要合成两种探针，一种是野生型探针，与无突变序列互补杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种是突变型探针，只与突变基因序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来.ASO杂交法ATACGTGC正常ASO突变ASO基因型:+/++/--/-杂交:++++++基因型:+/++/--/-杂交:++++++（二）聚合酶链反应（PCR）•直接采用PCR技术进行基因诊断；•常与其它技术如分子杂交、限制酶酶谱分析、单链构象多态性检测、限制性片段长度多态性分析、DNA序列测定等联合应用。•PCR-RFLP•PCR-SSCPPCR/单链构象多态性分析(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。正常人纯合突变杂合突变Leber病患者PCR/SSCP分析+﹣（三）基因测序•基因测序是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法；•可确定突变的部位和性质；•由于技术原因，目前尚难以直接在临床上应用。DNA诊断：以DNA为检测对象，探测DNA序列中的突变情况；RNA诊断：以mRNA为检测对象的诊断方法；常用的有RNA点杂交、Northern分析和定量逆转录PCR等。（四）基因芯片•近年来兴起的基因分析与检测的新技术，具有快速、敏感、高效、平行化、自动化等优点，将发展成新一代基因诊断技术；•可检测基因的结构及其突变、多态性，分析基因的表达情况；•按照基因芯片的用途将其分为表达谱芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、测序芯片、毒理芯片等。三、基因诊断的应用•遗传疾病•肿瘤•感染性疾病，传染性流行病•判断个体疾病易感性•器官移植组织配型•法医学中个体识别、亲子鉴定第二节基因治疗概念和方法基因治疗的基本程序基因治疗的应用与展望定义早期是指用正常的基因整合入细胞基因组，以校正和置换致病基因的一种治疗方法。目前广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。一、基因治疗的概念基因治疗的方法基因矫正(genecorrection)基因置换(genereplacement)基因增补(geneaugmentation)基因失活(geneinactivation)几种常见的基因失活技术①反义核酸技术②核酶技术③三链技术④干扰RNA(RNAi)技术基因治疗的其他方法：如“自杀基因”的应用，基因疫苗等自杀基因可产生细胞自杀效应•将“自杀基因”转移入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀效应”，从而达到清除肿瘤细胞的目的。二、基因治疗的基本程序治疗性基因的选择基因载体的选择靶细胞的选择基因转移外源基因表达的筛选利用在体中的标记基因回输体内病毒载体非病毒载体体细胞生殖细胞间接体内疗法直接体内疗法间接体内疗法直接体内疗法优点:1.高效转导2.基因高表达3.较大外源DNA的包装缺点:1.可能瞬时转染2.不能针对特异细胞3.病毒吸收普遍存在4.安全性三、基因治疗的应用与展望应用展望遗传性疾病、心血管疾病、肿瘤、感染性疾病、神经系统疾病进一步寻找切实有效的基因精密调控外源基因在人体内的表达体细胞移植和重建的生物学研究减少外源基因对机体的不利影响研究现状与应用•用正常的基因校正有缺陷的基因本身，以治疗遗传性疾病（三大类：单基因疾病、多基因性疾病、获得性疾病、与基因改变有关的感染和一些肿瘤）•目前仅限于体细胞，基因型的改变只限于某一类体细胞且只限某个体的当代。