辣根过氧化物酶的色原底物

辣根过氧化物酶的色原底物HRP最常用的色原底物有邻苯二胺(OPD)、2，2’—吖嗪—(3—乙酰苯基噻唑磺酸—6)[2，2’—azino-di(3—ethylben2thiazolinesulphonicacid-6)，ABTS](杂环吖嗪)、四甲基联苯胺(TMB)和4—氨基安替比林：苯酚耦联底物对等。上述色原底物受HRP作用主要有两种形式的反应：①氧化还原底物的氧化作用，如OPD、ABTS等；②一个氨基芳香剂与另一个芳香基化合物的氧化耦联，如4—氨基安替比林：苯酚等。(一)氧化还原色原底物OPD被认为是HRP最为敏感的色原底物之一，其在HRP的作用下，由过氧化氢(H202)氧化而聚合成2，2’—二氨基偶氮苯(DAB)。在pH5．0左右时，DAB在波长450nm处有广范围的最大吸收，当pH值降为1．0时，最大吸收波长移动至492nm，同时摩尔消光系数变大，显色加深(图4—2)。因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。实际工作中，用强酸尤其是盐酸终止反应后，显色并不稳定，常随时间增长而颜色加深，这是由于反应后剩余的过氧化氢继续氧化OPD而产生非酶催化的DAB的结果。有人在强酸反应终止液中加入还原剂如亚硫酸钠，因还原剂可迅速完全地将剩余的过氧化氢还原而阻止了OPD的非酶氧化，结果显色稳定，数十小时内不变，而且无需避光。OPD的缺点是其对机体具有致突变作用。由于OPD的不稳定性，现在的商品试剂盒中，OPD均以片剂或粉剂供应，临用时再溶解于相应的缓冲液。在ELISA测定时，OPD色原底物的具体配方为①显色底物溶液：在0．1mol／L枸橼酸盐缓冲液(pH5．0)中含20mmol／LOPD和12mmo!／LH202，或10mmol／LOPD和5．5mmol／LH202；②终止液：2mol／L硫酸(含0．1mol／L亚硫酸钠)；③测定波长：492nm。TMB是一种优于OPD的新型HRP色原底物。其氧化产物联苯醌在波长450nm处有最大消光系数，如果HRP量少，过氧化氢溶液和TMB过量时，则形成蓝色的阳离子根。降低pH，即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌(图4—3)。使用硫酸作为终止剂可使产物稳定90min，但随后本底显色就不断加深，国内有人认为使用1％SDS作为终止剂，可使鲜蓝色24h内保持不变，阴阳性对比十分明显，但在我们实验室发现1％SDS对上述显色有较强的褪色作用，目前仍以硫酸作为终止剂较为理想。ELISA中，底物反应显色后，常选择其具最大吸收的波长450nm比色测定结果。而’Madersbacher和Berger等为提高以TMB作底物的ELISA测定的敏感性，选择显色呈指数加深时的波长405nm比色测定。他们首先测定一系列已知浓度的标准品在450nm和405nm的值，证实A450nm／A405nm之比为3．2，然后在使用波长405nm测定含低浓度待测物的标本得到的OD值再乘以常数3．2，即为待测标本在波长450nm处的真值。该种双波长测定方法可使ELISA测定范围提高3倍。TMB的显色反应虽与OPD一样同属氧化还原反应，但前者的反应是可逆的，如终止液中存在还原剂(维生素C及亚硫酸钠、SDS等)，则可反应显色迅速消退。TMB虽然溶解度相对较低，但由于其高检测敏感性及无致突变作用，现已基本上取代了OPD而成为HRP最为常的色原底物。在商品ELISA试剂盒尤其是国内的产品中，TMB色原底物常为已配好的A及B两种液态试剂，其中一种是含一定浓度过氧化氢的溶液，一种为TMB溶液，鉴于过氧化氢、TMB在溶液中相对不稳定的特点，因此，我们在使用ELISA试剂盒时，如发现底物A和(或)B出现颜色，或二者各取一滴混合后显色，说明该试剂盒的底物溶液已变质或已受污染，必须废弃。在ELISA测定时，TMB色原底物的具体配方为①显色底物溶液：先将TMB以0．1mol／L的浓度溶于二甲亚砜，然后，再将其以1mmol／L和H202以3．0mmol／L的浓度溶于0．2mol／L醋酸钠／枸橼酸缓冲液(pH4．0)，即可应用。②终止液：2mol／L硫酸。③测定波长：450nm。ABTS也是HRP的一种高灵敏底物。在H：O：存在下，ABTS的氨盐转变为易发生歧化的阳离子根(图4—4)。阳离子根为绿色，与OPD的黄色氧化产物相比更适于可见光测定(测定波长入＝414nm)。上述显色也不稳定，10mmol／L叠氮钠是较为理想的终止剂，可使显色稳定数十小时，且可减少阳离子根的歧化。另有人报道用1．25％NaF终止反应效果较好。ABTS在目前国内的ELISA试剂盒中基本上没有应用，但在国外ELISA试剂盒偶见有应用。在ELISA测定时，ABTS色原底物的具体配方为①显色底物溶液：先将ABTS以2mmol／L和H202以2．5mmo!／L的浓度溶于0．1mol／L醋酸盐缓冲液(pH4．2)，即可应用；②终止液：10mmol／L叠氮钠；③测定波长；414nm或405nm。除上述三种外，HRP的氧化还原底物尚有O-dianisidine(ODA)，5—氨基水杨酸(5—AS)以及dicarboxindine等。(二)氧化耦联色原底物对HRP的氧化耦联色原底物对主要有4—氨基安替比林：苯酚耦联底物对(Trinder试剂)和2—甲基—2—苯并噻唑啉腙(MBTH)；二甲基苯胺(DMA)耦联底物对(Ngo—Lenhoff试剂)等。在H202存在下，4—氨基安替比林和苯酚经HRP作用缩合形成红色的醌亚胺，其在入＝492nm处有最大吸收(图4—5)。该耦联色原底物对用于固相ELISA时，敏感性一般较低，反应见光不稳定，而且苯酚易发生多聚化，缺乏适当的反应终止剂。因此，该试剂常限于葡萄糖、三酰甘油、肌酸激酶等临床生化指标的酶法检测应用。1989年日本学者用其作为色原底物建立了一种以HRP作标记酶的均相酶免疫试验，可用甲醛终止反应。但这种方法仅停留在实验室阶段，其后也未见有其他实验室的应用报道，可能还有其固有的缺陷。4—氨基安替比林：苯酚耦联底物对色原底物的具体配方为①显色底物溶液：将4—氨基安替比林以2mmol／L，苯酚以25mmol／L和H202以0．8mmol／L的浓度溶于0．1mol／L磷酸盐缓冲液(pH7．2)，即可应用；②终止液：未见报道；③测定波长：492nm。MBTH和DMA在HRP的作用下缩合生成紫蓝色的吲达胺(indamine)，最大吸收波长为590nm，见光不稳定。用盐酸或硫酸终止反应后，pH应为3．0左右，pH值的降低使显色从紫蓝色转变为清晰的蓝色，最大吸收波长从590nm变为595nm，然而pH值的进一步降低，将导致光吸收消失。MBTH：DMA耦联对在固相ELISA测定几乎没有应用。