环境生物技术(CRISPR张锋)

CRISPR“上帝的剪刀”领军人物Noobjectismysterious.Themysteryisinoureyes.张锋生平经历基因编辑技术CRISPR系统专利之争生平经历01低调的80后1983年出生于河北石家庄，美国麻省理工学院博士，是当今最为人所关注的华人生物学家之一。从诺贝尔奖有力得主，福布斯40岁以下最有成就的40人，《自然》杂志十大科学人物，到华裔新移民和80后。张锋这个并不出彩的名字，因为CRISPR-CAS9站到了时代和舆论的风口浪尖。这项被誉为“上帝的剪刀”的技术让人们拥有了前所未有的基因编辑能力，让我们有机会以低廉的成本精确的替换掉病变的DNA片段，从而达到治疗或者缓解疾病的目的。也许因为从事较为前沿的计算机行业，张锋的父母更能看到国内教育的局限性。为了能让他得到更好的教育，他的母亲在1993年带他移民到了美国的爱荷华州。在一节课上，老师给学生们播放了《侏罗纪公园》，从小就喜欢编程的他，从这个电影学到了，生物也许也是一个可以被编程的系统。为此他参加了特长班，与国内特长班不同的是，大多数的公立学校都会有自己的课后特长班，一般面向的都是幼儿园到9年级的学生（也就是国内的初中毕业）。高中之后的特长班都会更加的有针对性也更专业，这时候的项目通常是由国家级的教育基金支持，并与当地大学或者研究所或者其他教育机构进行接轨。新移民的基因编程梦01正是得益于这个项目，张锋的辅导老师把他引荐到了他的第一位人生导师约翰•利维（JohnLevy）的实验室。在这里，他利用病毒把水母中可以发光的基因注入到了一个人体黑素瘤细胞中，这是他第一次把一个物种的基因转移在另一物种上。这时的他还在读高二。到斯坦福读博士的张锋遇到了他的另外一个重要导师，卡尔·代塞尔罗思（KarlDeisseroth）。张锋阴差阳错的进入了这个刚刚成立的实验室，成为了他的首个学生。就是这样的一对组合，在几年后，创造出了一个可以用光来精准的控制脑神经的全新技术。这项技术因为其可能带来的巨大影响而被《自然》杂志选为年度技术。斯坦福毕业的张锋想要研究一些更广的问题。在试图搞清某些疾病原理的时候，他发现这些疾病都和人的基因结构有关。因而张锋决定要做的是去“快速地，系统的去验证和找到基因病变的因果关系。”0203创业者一样的科学家研究历程发现问题疯狂实验巨大成功张锋在博德研究所拥有了自己的实验室。就像众多其他的实验室一样，他们通过使用TALES和ZFN进行着基因编辑研究。通常，他的一个学生需要用三个月的时间去准备一次实验需要的道具。这对于张锋来说，简直是不可接受的慢。在2011年，一个来自加拿大拉瓦尔大学的教授在博德研究所进行了一个关于CRISPR-CAS9技术的讲座。这是张锋第一次听说到这个技术。敏感的张锋意识到，这个一直被用在酸奶行业的CRISPR-CAS9技术具有搜寻和破坏特定DNA的特点，那么同样的，它是否能被用在人类细胞的可能性？此时把研究重心转移绝对算得上是一个大胆的冒险，但是对于张锋来说，这里却有他想要的东西：伴随着高风险的高回报。当他的学生丛乐听完张锋的理由后，他理解了张锋的激动。原来的TALES一直使用蛋白来进行基因编辑，但是长时间的准备换来的却是令人沮丧的高脱靶率，而CRISPR-CAS9所使用的RNA则使得这个过程变得更加的简单可控。于是他和丛乐便对它展开了疯狂的研究。张锋的冒险精神和远见在这里又一次得到了体现。当时大多数科学家都会从简单的细菌开始熟悉这个技术，而张锋选择的则是直接在老鼠和人体细胞中做实验。他成功了。在2012年，他们在《Nature》杂志上发表了他们的研究成果，成为了CRISPR-CAS9真核细胞基因编辑领域发表最早、被引用数量最多的论文之一。从一名对有天赋的高中生，到生物实验室的研究员，到精准控制神经的光遗传学创始人，再到CRISPR-CAS9基因编辑的领军人物。在这个清晰的成长脉络前,张锋的成就变得不那么令人惊讶。基因编辑技术02基因编辑技术基因编辑就是通过对细胞基因组中目的基因的一段核苷酸序列甚至是单个核苷酸进行替换、切除，增加或者是插入外源的DNA序列，使之产生可遗传的改变。与射线或化学诱变剂导致的DNA随机突变不同的是，基因编辑技术是定向改变基因的组成和结构，具有高效、可控和定向操作的特点。虽然各种基因编辑技术的原理及作用方式并不相同，但它们的共同之处是基因编辑都建立在使目标基因DNA产生双链断裂(DoubleStrandBreaking,DSB)的基础上。因为DNA分子单链断裂或缺失后容易被细胞内的各种修复机制所修复而不产生任何改变。同源重组从使基因发生定向改变这个角度而言，早期的基因编辑技术可以追溯到同源重组这种方法。基于同源重组的基因编辑被称为基因打靶或基因靶向技术(genetargeting)，例如依赖大肠杆菌细胞内的RecA或酵母的RAD54重组酶，基因靶向技术可以对目标基因或基因的部分序列进行替换、删除，或在细胞内存在同源序列的情况下插入外源DNA序列。运用同源重组对基因进行编辑的方法已经在微生物、植物和动物中取得了成功缺点：该方法的一个主要局限在于重组频率低，约为10−4~10−5。虽然对微生物及培养的动物细胞系、甚至对一些苔藓植物如小立碗藓来说，同源重组技术可以获得满意的基因编辑效率，但对高等植物或动物，基于同源重组的基因靶向技术由于效率太低，在实践上难以广泛应用锌指核酸酶(ZincFingerNuclease,ZFN)人工核酸酶ZFN可以算是第一种具有普遍适用性的基因编辑技术。我们知道，分子生物学中广泛使用的工具酶主要是II型限制性核酸内切酶，绝大多数情况下这些酶的切割位点位于其DNA识别序列之中。不过，IIS型的核酸内切酶(如FokI)则不同，其识别序列和切割序列相距9个核苷酸，并且切割和识别功能分别由酶蛋白的不同结构域完成。人工核酸酶正是利用了IIS型核酸内切酶的这一特点，在保留它的非特异的酶切割功能结构域的基础上，将其DNA识别结构域用能够识别特定核苷酸序列的、人工合成的结构域取代，这样就构成了能够根据人们的需要而识别特定DNA序列并进行切割的人工核酸酶。缺点：一个突出的问题是所谓的脱靶效应，即合成的核酸酶并没有对预先设定的目标DNA序列进行识别和切割。出现这种情况的原因在于组成人工核酸酶的各个锌指结构单元之间存在相互影响，即存在所谓上下文依赖(Context-dependant)，也就是说将不同锌指结构单位连接起来后，其DNA识别序列并不是它们单独存在时分别识别的核苷酸组序列的简单相加。转录激活子样效应因子核酸酶TALEN(TranscriptionActivationLikeEffectorNuclease)在ZFN问世不久，另一种人工核酸酶TALEN也被开发出来。与ZFN一样，TALEN也是利用一种对DNA分子特异识别的蛋白结构与FokI的酶切活性结构域组合形成的。与ZFN不同的是，TALEN利用的是黄杆菌(Xanthomonas)的转录因子激活样效应因子(TranscriptionActivationLikeEffector)中DNA序列识别模块作为特异识别DNA序列的基础。缺点：在编辑效率方面，TALEN虽然也还没有达到理想的程度，但相对于ZFN还是有所提高，并且有更好的特异性，使其在医疗用途中更加安全，不过脱靶效应仍然存在。规律性间隔的短回文序列重复簇(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats/CRISPR-AssociatedProteins,CRISPR)整个CRISPR/Cas9系统使用起来非常简单：只需要根据目标序列设计引物扩增spacer，再将其整合进含有tracRNA和Cas9表达盒的载体，就完成了基因编辑载体的准备工作。此外，为适应真核生物的细胞结构，一般在设计编辑载体时要在Cas蛋白编码序列一端或两端加上核定位信号。目前很多实验室已经构建了专门用于基因敲除的CRISPR/Cas9载体。对生物学领域的研究者来说，CRISPR的优势在于它能非常方便的对感兴趣的基因进行编辑使之产生突变，从而极大的方便了阐明每个基因的功能。然而，医学领域的专家更关注运用该技术进行基因治疗的潜力。尽管目前还只是处于初始阶段，但可以预料，CRISPR将给生命科学和医学领域带来难以估量的重要影响。体外治疗体外治疗为将病人体内需要被改造的细胞取出，在体外进行培养与改造，然后将改造后的细胞导入体内。例子：将HIV携带者体内的CD4阳性T细胞表面的CCR5受体进行突变，然后导入体内，发现这一做法能够有效提高患者CD4阳性T细胞数量与减轻HIV恶化程度。体内治疗为直接将改造材料注入患者体内，可以是系统性地改造，也可以是局部的改造。例子：对于小鼠B型血友病的治疗，通过体内导入重组因子IX，小鼠病情得到了减轻。基因编辑技术具体治疗手段与成功案例体内治疗CRISPR系统03技术背景为了研究某些疾病的原理，科学家们需要工具把基因拆开来研究，而这也就是基因编辑学的根本成因。在此之前，科学家们已经成功利用TALES（类转录活化因子核酸酶）和ZFN（锌指核酸酶）进行基因编辑，然而高昂的成本，冗长的准备，和低下的效率让这个领域一直处于行业边缘。而CRISPR-CAS9技术的出现，则是彻底的颠覆。资本的宠儿，疾病的克星，被夸上天的CRISPR系统到底是？特殊DNA重复序列家族（基因编辑器）一种蛋白一种基因编辑技术重复规律性间隔的短回文序列重复簇（一种免疫系统）来源CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA，是一种对付攻击者的基因武器。CRISPR/Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应的CRISPRRNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。可用来删除，添加，激活或抑制其它生物体的目标基因。应用CRISPR-Cas技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES细胞打靶和TALEN等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔，是一种可以广泛使用的生物技术。CRISPR-CAS9的来源及应用px458载体crispr/cas9系统质粒定点切割CRISPR/Cas9通过对预设的DNA位点进行切割，造成DNA双链断裂（DSB,doublestrandbreak）。这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制同源介导的修复（HR,homology-direc·tedrepair）基于同源重组的修复机制保真性高，但是发生概率低。在提供外源修复模板的情况下，靶向核酸酶对DNA的切割可以将同源重组发生的概率提高约1000倍非同源末端连接途径（NHEJ，Non-homologousendjoining）此修复机制非常容易发生错误，导致修复后发生碱基的缺失或插入（Indel），从而造成移码突变，最终达到基因敲除的目的。CRISPR/Cas9技术的出现，使得无需再使用相应物种的ES细胞系就可以制备基因敲除模式生物010302CRISPR-CAS9编辑机制优点▪在构建和使用时非常简单、方便▪利用其可以同时对多个基因进行打靶的优势，可以逐条甚至批量检测人类或动物基因组中的基因表达和互作情况，以明确基因的功能及调控网络▪弥补了传统基因编辑技术的诸多不足，使得基因的“任意编辑”变得越来越容易▪成本较低缺点▪质粒仍然较大，转染难度相对较大▪具有碱基识别偏好性，局限了基因编辑的运用范围▪会导致不同基因位点编辑效率不同。筛选仍然需要较大工作量。CRISPR-CAS9技术优缺点一优点二三四五CRISPR-Cpf1只需一个协助RNA分子。Cas9系统需要2个RNA分子协助，Cpf1只需要一个RNA分子。Cpf1酶分子量比Cas9小，进入细胞更容易，编辑成功率会提高。Cpf1系统不同的识别序列令其基因编辑效果更好。剪切位置与Cas9不同，选择余地更大。产生黏性末端，便于新DNA序列