第8章 基因工程菌的培养

发酵染菌及其防治知识点回顾•染菌对发酵生产的影响染菌对不同产品发酵过程的影响不同时期发生染菌对发酵的影响染菌程度对发酵的影响发酵染菌及其防治知识点回顾•发酵染菌的途径分析发酵染菌后的异常表现染菌的检查判断染菌原因分析发酵染菌及其防治知识点回顾•发酵染菌的常见种类及防治对策种子带菌及防治空气带菌及防治操作失误导致染菌及其防治设备因素造成的染菌及其防治噬菌体的污染及其防治第八章基因工程菌的培养张杰山西师范大学生科院微生物课程组应用与环境微生物专业基因工程药物内容提要•概述•宿主-载体系统•基因工程菌生产的特性•重组大肠埃希氏菌的高密度培养策略•基因工程菌生长与表达的影响因素•毕赤酵母（Pichiapastoris）的表达策略8.1概述基因工程菌生产的主要产品有两类，即蛋白质和非蛋白质。非蛋白质产物可以通过代谢工程细胞来获得，这些细胞插入编码酶的DNA，产生新的途径或增强某一途径，从而得到新的化合物或增加产量。8.2宿主-载体系统8.2.1宿主系统构建基因工程菌，必须选择合适的宿主和表达系统，一般希望翻译后的处理要简单，如果用于食品要考虑宿主菌是否列入美国食品药品管理局表中，列入的被认为是安全的菌。常用的宿主系统有：E.coli、G+细菌，低等真核细胞和哺乳动物细胞。8.2宿主-载体系统8.2.2表达系统1.G-细菌通用的表达载体细菌基因工程的表达系统由三部分组成：外源基因、表达载体和宿主细菌。目前大多数重组DNA技术生产的蛋白质都是在大肠埃希菌中合成的，它是目前研究最深入，使用最广泛的基因工程宿主菌。E.coli作为宿主的优点•生理学和遗传学背景很清楚；•有利于进行复杂的基因操作；•相当高的生长速率，并能得到高细胞浓度（50g/L）；•能在简单便宜的培养基上生长；8.2.2表达系统2.G+细菌表达载体枯草芽孢杆菌是可替代大肠埃希菌的菌种，没有外膜，能够运动，并且能把蛋白分泌到胞外的杆状细菌，无致病性，对人畜无毒，是G+细菌的主要代表。8.2.2表达系统2.G+细菌表达载体枯草芽孢杆菌产生大量的蛋白酶，会很快降解产物。构建比E.coli困难，质粒稳定性也比较差，在使用上有较大的限制。穿梭载体和整合载体。8.2.3微生物表面表达系统包括载体蛋白、目的蛋白和宿主菌三部分。位于细胞表面的蛋白都可以用于细胞表面展示。常见的载体蛋白包括大肠杆菌的外膜蛋白和与肽聚糖相关的脂蛋白、假单胞菌的外膜蛋白、蜡状芽孢杆菌群的S-层表面蛋白、葡萄球菌的表面蛋白。为了将目的蛋白展示于微生物细胞表面，还需要构建目的蛋白和外表面蛋白的融合。8.2.4低等真核细胞酿酒酵母是第一个被利用的生物，它的最大生长速率是大肠杆菌的25%，酵母细胞比最大的细菌大，容易从发酵液中回收，有简单糖化能力和分泌蛋白的能力（优点）。酵母菌达到高表达水平比大肠杆菌困难，外源蛋白分泌到胞外也有困难（缺点）。外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译后修饰，低等真核细胞就不能适应，要用动物细胞组织培养来达到。8.2.5哺乳动物细胞提供最接近于天然副本的产物，此外多数产物可以分泌到胞外。但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵，蛋白质表达水平较低。用于重组DNA生产蛋白的最常用的宿主是CHO（ChineseHamsterOvary，中国仓鼠卵巢细胞）。8.3基因工程菌生产的特性•带有外源基因，可能在质粒上，也可能整合到染色体上，这些基因可能不稳定。丢失外源基因的菌往往比未丢失的菌生长的快，这样就会大大降低产物的表达。•为了抑制基因丢失的菌的生长，一般在培养基中加入选择压力，如抗生素。•基因工程菌的培养一般分两段：菌体生长、诱导产物表达。8.3基因工程菌生产的特性8.3.1基因工程菌的不稳定性稳定性是实现外源基因产物高水平生产的必要条件。不稳定性的主要表现：分离丢失、结构不稳定性和宿主细胞调节突变。8.3基因工程菌生产的特性8.3.2分离丢失细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出现分离丢失。低拷贝质粒（1-2个拷贝/细胞）：专门的机制保证在子代细胞中有相等的分配；高拷贝质粒（20拷贝）：很少遵循二分法分配到子代细胞中。环境因素：溶氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀释速率。8.3基因工程菌生产的特性8.3.3质粒结构不稳定保留质粒，但结构发生改变，而不产生外源蛋白，较少对细胞的有害影响；质粒突变，仍保留了抗生素抗性基因，但不合成外源蛋白，生长比原来的工程菌更快，改变了质粒占优势地位的菌，这样的培养情况也是结构的不稳定性。两方面的因素：细胞生长分裂时丢失；质粒DNA发生变化。8.3基因工程菌生产的特性8.3.4宿主细胞突变造成生产能力的减少。这些突变通常改变细胞调节，结果减少目标蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表达，利用宿主细胞的启动子，当宿主细胞启动子改变，将大大改变质粒编码蛋白的生产水平。8.4重组大肠杆菌的高密度培养策略重组菌生长的障碍：携带外源基因，加重代谢负担，生长缓慢。重组蛋白不能分泌到胞外，外源蛋白在菌体内合成后就会造成伤害。高表达的外源蛋白尤其是高度疏水性蛋白对菌体有害，对细胞生长有抑制作用，甚至会导致细胞中毒或死亡。重组大肠杆菌高表达的障碍主要有：外源基因的不稳定性；高生长速率与高表达之间的矛盾；乙酸的产生、蛋白的降解。8.4重组大肠杆菌的高密度培养策略实现大肠杆菌的高密度培养，最常用和最有效的方法就是分批补料流加培养法。现在常用的是反馈补料培养，有几种反馈控制：控制基质浓度流加、恒pH流加、恒溶氧流加、控制比生长速率的葡萄糖流加等。8.4重组大肠杆菌的高密度培养策略8.4.1控制基质浓度流加用专门的电极维持基质浓度（如葡萄糖、乙酸、氨等）。8.4.2恒pH流加大肠杆菌分解LB培养基中的胰蛋白胨，造成氨积累的积累。用葡萄糖代替酸液进行恒pH流加。通过pH反馈控制系统流加葡萄糖，使pH恒定，结果推迟了比生长速率的降低时间，细胞密度是无流加的2倍。8.4重组大肠杆菌的高密度培养策略8.4.3恒溶解氧流加用富膜氧电极来控制补糖。当培养液的溶解氧浓度高于控制点，糖阀开启，以一定速率补糖。加入的糖被菌利用则需要更多的氧，从而减少溶解氧浓度，引起读数下降。8.4.4控制比生长速率的葡萄糖流加菌体的生长速率与代谢产物的表达密切相关。比生长速率太大，超过某一值，易产生乙酸，这一比生长速率值称为菌体的乙酸产生临界比生长速率。8.5基因工程菌生长与表达的影响因素一些基因工程菌芽孢杆菌在较高的比生长速率下显示较差的质粒稳定性。影响连续培养中带有质粒细胞和丢失质粒细胞比例变化的主要因素是二者比生长速率的差异和基因工程菌丢失质粒的概率。8.5基因工程菌生长与表达的影响因素8.5.1溶氧浓度对工程菌发酵的影响DO1.8~2.6mg/L时，菌体湿重1.9~2.08g/L，外源基因表达量为13.8~16.7%；DO4.0mg/L时，菌体湿重2.27g/L，外源基因表达量为26.4%；诱导表达期间，要维持外源基因的高水平转录和翻译，细胞需要大量的能量代谢以促进呼吸作用。因此通过增大通气量和提高搅拌转速以保证较大的溶氧值，不仅能提高工程菌的生长而且有利于外源蛋白产物的形成。8.5基因工程菌生长与表达的影响因素8.5.2pH对工程菌生长和表达的影响偏碱性pH对外源蛋白的表达不利，因此，基因开始要调节pH在6.8~7.0之间，以保证外源蛋白的高水平表达。8.5.3诱导时间对外源蛋白表达的影响诱导时间是指加入诱导剂后的培养时间。8.5基因工程菌生长与表达的影响因素8.5.4诱导时机对表达的影响在菌体对数生长期加入乳糖诱导相对较好，即菌浓OD600为1.0左右，DAAO基因工程菌可表达较高的酶活。8.5基因工程菌生长与表达的影响因素8.5.5乙酸对生长和表达的影响1、乙酸的产生及抑制作用机制当葡萄糖加入量超过菌体生长和二氧化碳产生所需要量或在缺氧的条件下便会产生大量的乙酸，特别是在培养时间较长的高密度发酵过程中，问题更为严重。8.5.5乙酸对生长和表达的影响1、乙酸的产生及抑制作用机制细菌在低比生长速率下通过氧化代谢的作用产生的能量足以满足合成和异化的需求，不会产生乙酸，而在高比生长速率时，大肠杆菌仅靠氧化代谢不能提供足够的能量，必须通过乙酸生成途径储备ATP和NADH。8.5.5乙酸对生长和表达的影响1、乙酸的产生及抑制作用机制乙酸在中性pH环境中以离子化（CH3COO-）和质子化（CH3COOH）两种形式存在，质子化的乙酸具有弱的亲脂性，可以穿过细胞质膜进入胞内，在细胞内（7.5）解离成CH3COO-和H+，这样就降低了膜内的pH，使膜内外pH差减少，减弱了质子的推动力，产生的能量就达到减少，扰乱了细胞的正常代谢和生理活性。8.5.5乙酸对生长和表达的影响2、减少乙酸积累的策略1）诱变宿主菌，使乙酸合成受阻；2）改变培养基组成，特别是碳源的含量影响最大；3）降低比生长速率，细菌比生长速率高，乙酸的比生成速率就高；4）降低培养温度，从37℃降低到26~30℃可以降低菌体对营养物的吸收率，减少有机酸的形成；5）采用透析培养，在重组菌的培养过程中可以利用透析技术除去发酵液中有害物质，降低乙酸含量从而实现重组菌的高密度发酵。8.6毕赤酵母（Pichiapastoris）表达策略8.6.1酵母作为宿主菌的优点易于培养、繁殖快、便于基因工程操作，具有真核生物的蛋白质翻译后加工的功能，具有适合于真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境和糖链加工系统，分泌外源蛋白到培养液中，利于纯化。8.6毕赤酵母（Pichiapastoris）表达策略8.6.1酵母作为宿主菌的优点酿酒酵母表达系统存在的问题：①缺乏强有力的严格调控的启动子；②分泌效率低；③表达菌株不够稳定，表达质粒易于丢失；④不适合高密度培养8.6毕赤酵母（Pichiapastoris）表达策略8.6.1酵母作为宿主菌的优点甲醇营养型酵母作为第二代酵母表达系统。能利用甲醇作为唯一的碳源和能源；甲醇代谢所需的三种酶被分拣到转运入过氧化物酶体中，形成区域化。8.6.1酵母作为宿主菌的优点甲醇营养型酵母作为第二代酵母表达系统。优点：①应用AOX启动子，转录效率高，易于诱导调控；②表达质粒易于整合到基因组，不易丢失，适于高密度发酵，表达量高；③表达产物选择性进入过氧化物酶体等8.6毕赤酵母（Pichiapastoris）表达策略8.6.2三角酵母D-氨基酸氧化酶在毕赤酵母中的表达DAAO主要用于裂解头孢菌素C生成戊二酰基-7-氨基酸头孢烯酸第一步反应。8.6毕赤酵母（Pichiapastoris）表达策略8.6.3重组质粒8.6.4重组毕赤酵母菌株发酵8.6.5重组菌株在5L发酵罐中培养小结•四种主要的宿主表达系统•重组大肠杆菌高密度培养的策略分批补料连续流加培养控制基质浓度流加、恒pH流加、恒溶氧流加、控制比生长速率的葡萄糖流加等。基因工程菌生长与表达的影响因素溶解氧、pH值、诱导时间、诱导时机、乙酸产生及影响