第六章动物体外受精技术..

第六章动物体外受精技术河南农业大学韩雪蕾目录第一节体外受精技术概述第二节卵母细胞的体外成熟第三节体外受精方法试管婴儿1978年7月26日，世界首例试管婴儿“路易斯．布朗”在英国诞生，现已成为母亲。转基因试管牛我国首例转基因试管牛“滔滔”于1999年2月19日在上海诞生1988年3月10日我国首例试管婴儿根据资料回答下列问题：1.资料上用到了什么生物技术？试管婴儿技术（包括体外受精、早期胚胎培养）和胚胎移植技术。2.试管婴儿和母亲正常怀孕，生产的过程有何异同？相同之处：都通过有性生殖产生，在母体子宫内发育形成胎儿。不同之处：受精作用在体外，并在体外发育成早期胚胎进行胚胎移植。第一节体外受精技术概述从狭义上讲，体外受精是指将动物受精过程中的精卵结合在体外环境下完成的一种现象，包括自然条件下的体外受精和人为培养条件下的体外受精。通常所指的体外受精技术，即为将哺乳动物的精子和卵子置于体外适宜的培养条件下使之完成受精的一种技术。在生物学中，把体外受精胚胎移植到母体后获得的动物称试管动物(test-tubeanimal)从广义上讲，体外受精又包含卵母细胞的体外成熟培养和受精卵的体外培养两项密切相关的技术。一、体外受精技术的概念一、基本原理：人工模拟体内环境（包括营养、温度、pH等），使初级卵母细胞成熟，同时使精子获能，最终完成受精作用，并有计划地保存胚胎。二、体外受精技术的发展概况哺乳动物体外受精的研究已有120多年的历史。1878年，德国科学家Schenk首先开始哺乳动物体外受精的尝试。1944年，Pock和Menkin进行了人卵的体外受精研究。精子获能现象的发现，是哺乳动物体外受精发展史上的里程碑。1959年，美籍华人张明觉获得了世界上第一批体外受精的试管小兔。此时，体外受精技术才真正得到承认并为人们所接受。先后在近20余种动物进行了体外受精的研究，有10余种动物获得了体外受精的试管动物。目前，一套高效的牛胚胎体外生产程序已建立起来。我国体外受精技术的研究起步于80年代后期，但进展很快，已先后在人和牛等8种动物取得成功。目前，人和牛的体外受精技术已达到国际先进水平，每年约有近千例试管婴儿诞生，数百头试管牛出生。1990年我国钱菊芬获得首例试管山羊旭日干、范必勤等获得试管牛犊三、体外受精的意义体外受精技术对动物生殖机理研究、畜牧生产、医学和濒危动物保护等具有重要意义；在家畜品种改良中，体外受精技术为胚胎生产提供了廉价而高效的手段，对充分利用优良品种资源，缩短家畜繁殖周期，加快品种改良速度等有重要价值；是哺乳动物胚胎移植、克隆、转基因和性别控制等现代生物技术不可缺少的组成部分；四、体外受精技术环节卵母细胞的获得和体外成熟精子的体外获能成熟卵母细胞与获能精子的体外受精受精卵的体外培养受精卵的移植五、体外受精技术的应用范围（一）、基础研究1.再现体内受精过程2.研究珍稀动物的早期胚胎发育3.研究细胞膜融合现象和机理（二）、应用研究1.治疗人类不孕症2.为胚胎移植产业开辟大量胚胎来源3.家畜品种改良4.保种5.其他用途第二节卵母细胞的获得与体外成熟一、卵母细胞的采集方法获得足够数量的卵母细胞是生产试管动物的前提。1.卵母细胞的离体采集（1）卵泡抽吸法：用注射器套上12~16号针头穿刺卵泡而将卵母细胞抽吸出来。注射器保持一定负压，针头从卵泡侧面刺入，一次进针抽吸卵巢皮质多个卵泡，避免污染。优缺点：回收速度快，不易造成污染；容易损伤卵母细胞周围的卵丘细胞（2）卵泡剥离法：用无菌眼科剪刀或刀片，自卵泡周围，将周围组织分离，取下完整的圆形卵泡，放到加油培养液的平皿中，切开卵泡，卵泡液带着卵母细胞流出。优缺点：程序较为复杂，但是对卵丘-卵母细胞复合体的损伤小。（3）切剖法：用平行排列成组的剃须刀片纵横切割卵巢，回收液体放在捡胚皿中，37度培养箱静止10min，用注射器吸取上清，镜检卵母细胞。优点：回收效率较高。（4）卵巢解剖法：用手术刀片将卵巢切为两半，去掉中间髓质部分，露出卵泡，然后用刀片划破卵泡，在培养液中反复冲洗，采集其中的卵母细胞。优缺点：回收速度相对较慢，容易造成污染；能保持卵母细胞周围卵泡细胞的完整性，回收率相对比较高。2.卵母细胞的活体采集（1）腹腔镜法：在腹壁切开一个小口，插入腹腔镜、操作杆和穿刺针，通过操作杆和穿刺针的配合将卵母细胞吸出。优缺点：比较直观，容易掌握；工作量大，对母牛的损伤较大，不能频繁手术。（2）B超超声波法：将供体母畜牢牢固定在保定架内，普鲁卡因麻醉，将带有超声波探头和采卵针的采卵器插入到阴道子宫颈一侧穹窿处。而后术者通过直肠将卵巢贴在探头上，根据B超屏幕上显示的卵泡位置进行穿刺，而将卵母细胞取出。优缺点：不用进行手术，操作速度较快，对母牛损伤小，可频繁反复采卵，也可对妊娠母牛进行采卵；操作技术较难掌握，并需要昂贵的超声设备。牛卵巢牛卵巢中采卵B超活采仪活体采集的牛卵母细胞合格卵母细胞标准：放射冠细胞扩散良好，质地均一，放射冠细胞间透明；透明带清晰；卵母细胞圆形，直径大小适中，细胞质质地均匀，色泽柔和，透明度适中。2、体外成熟的卵母细胞1）卵母细胞来源（1）卵巢来源：从屠宰场宰杀的母畜获得卵巢，38°C生理盐水中保温，宰杀后2小时内运回实验室。图－1成熟卵母细胞图二、卵母细胞的分类（2）采集卵母细胞－卵丘细胞复合物：用38℃生理盐水洗涤卵巢2次，左手持卵巢，右手持注射器，如图所示，抽取3－5mm卵泡的卵泡液及卵母细胞－卵丘细胞复合物，置于20ml试管内，静置待检。选择3~5mm卵泡的原因是：更大卵泡的闭锁比例可能较高，更小卵泡的发育程度可能低。•镜检卵母细胞－卵丘复合物：•用吸管吸取经静置后试管底部的混合物于平皿中，用吸管铺平，在实体显微镜下用吸管检出卵母细胞－卵丘复合物，置于另一平皿中，用洗涤液在实体显微镜下洗涤2次，在洗涤过程中要剔除不合格的卵母细胞－卵丘复合物。选择合格的卵母细胞－卵丘复合物非常重要，否则将降低卵母细胞的成熟比例。•卵母细胞－卵丘复合物分类标准a、分类依据：卵母细胞的直径、形状、质地的均匀度、色泽；透明带的完整性；卵丘细胞围绕卵母细胞的完整性、数量、扩散程度、色泽。一般分为4级，1、2级为合格；3、4级为不合格。一级：卵母细胞：直径120μm，圆形，质地均匀。卵丘细胞：包围卵母细胞数层、紧密、完整，质地均匀。二级：卵母细胞：直径120μm，圆形，质地均匀。卵丘细胞：包围卵母细胞数层、紧密，但不完整，质地均匀。三级：卵母细胞：直径太大或太小，椭圆形，质地均匀。卵丘细胞：包围卵母细胞单层或无、不紧密、不完整，质地均匀。四级：卵母细胞：直径太大或太小，椭圆形，质地不均匀。卵丘细胞：包围卵母细胞单层或无、不紧密、不完整，质地不均匀。退化的卵母细胞可用卵母细胞三、卵母细胞的体外成熟未成熟的卵母细胞的核在细胞中央，成熟过程中迁移到动物极质膜下，核变得膨大，改称发生泡，接着进行第一次成熟分裂，减数分裂的完成标志着卵母细胞核的成熟（1）细胞核成熟（2）细胞质的成熟显著的蛋白质合成发生在生发泡破裂前后，这些新合成的蛋白质不仅与卵细胞自身成熟有关（激活成熟促进因子），而且与卵母细胞输精后的发育能力直接有关，所以细胞质成熟的质量如何直接影响到早期胚胎的发育能力胞质成熟主要表现为细胞器变化和纺锤体的形成卵母细胞成熟后期细胞器完成重新组装，如高尔基体消失，线粒体分布核的周围，胞质内有PAS阳性的囊膜和脂滴（3）细胞膜和透明带的成熟细胞膜稳定性发生改变，膜微绒毛发生重排，表现密集而有弯曲，并从透明带内退出或断裂透明带外层呈网状，变软三、卵母细胞的体外成熟方法1.成熟培养液的选择用于卵母细胞体外成熟的基础培养液有TCM199、Ham’sF-10等，添加胎犊血清（FCS）和犊牛血清（NCS）比添加牛血清蛋白（BSA）效果较高。可添加hCG和PMSG，促进卵母细胞的体外成熟。2.成熟培养的时间对于大多数家畜来说，卵母细胞的成熟培养时间一般采用22～24h，但猪的卵母细胞多采用40～44h，马的卵母细胞多采用30～36h。兔仅需12～15h。3.成熟培养的温度和气相环境（1）温度牛、猪、羊、马的卵母细胞成熟培养温度均采用38～39℃。（2）气相环境一般都采用5％CO2，来维持培养液的酸碱度；4.成熟培养系统（1）开放培养系统体积：将1～2ml成熟培养液置于平皿或五孔培养板中，然后放入50～200枚卵母细胞。优点：简单；同时培养大量的卵母细胞；培养结果不受石蜡油质量的影响缺点：渗透压的变化较大；容易污染（2）微滴培养系统体积：将成熟培养液在培养皿中做成50～500μl的微滴，覆石蜡油。优点：渗透压比较稳定；不易污染缺点：对培养液中的脂溶性物质有稀释作用；成本较高；培养结果易受石蜡油质量的影响，目前很少用。（3）密闭培养系统体积：将卵母细胞置于1～2ml成熟培养液的试管中，加盖胶塞。优点：不需要CO2培养箱，可用恒温水浴；方便运输缺点：pH值不如前者稳定适合需要再卵母细胞的运输途中进行成熟时应用。卵母细胞的成熟培养：CO2培养箱卵母细胞的成熟培养：CO2培养箱三、卵母细胞体外成熟质量的评定1.形态观察法：主要通过显微镜下观察卵母细胞的形态来判断是否成熟。2.固定染色法：将卵母细胞周围的卵丘细胞用0.1%的透明质酸酶去掉，然后在醋酸酒精的固定液中固定24~28h，最后用含1%间苯二酚兰染色观察。分为7个阶段：（1）生发泡期（GV期）卵母细胞的胞质中可见到一个大而圆的细胞核（俗称生发泡），核膜清晰，界限明显。生发泡：生长期的卵母细胞核内核仁增大增多、合成活跃，细胞核膨大，称为生发泡。（2）生发泡破裂期（GVBD）核膜变得模糊，核膜的一侧出现缺口，染色质隐约可见。(3)终变期（DK期）染色质变短、变粗，随即分布在细胞核区。（4）中期Ι(MI期)染色体成对排列在赤道板上，并可隐约见到纺锤体。（5）后期Ι（AnaI期）同源染色体开始分开，但两组染色体分开的距离不大。（6）末期Ι(TelI期)同源染色体分开的距离加大，形成极体的一组染色体向质膜靠近，但此时极体尚未排出。(7)中期Ⅱ(MⅡ期)卵周隙中可见到极体，与相邻的胞质中可见到整齐排列的染色体。与MΙ期的染色体相比，MⅡ期的染色体小而致密。3.受精和胚胎发育潜能的评定：是评定卵母细胞体外成熟方法最为重要的一项指标。体外受精后的受精卵（分）裂率体外培养的胚胎发育率可用卵母细胞成熟卵母细胞第三节体外受精的方法1.配子的来源（1）卵子输卵管卵卵泡卵（2）精子体内获能的精子体外获能的精子2.精子制备的方法：（1）悬浮法：是根据精子运动上游的特性而将高活力的精子与死精子以及其他精浆成分分开。将精液置于含有1~1.5ml获能液或受精液的试管底部，在培养箱中孵育10~30min，吸取上层液体，然后离心洗涤1~2次，即可获得高活力的洁净精子。优缺点：适用于精子活力较差的精液，但是精子的可利用率则大大降低。（2）玻璃棉过滤：采用玻璃柱层过滤分离，可有效的出去品质较差精液中的死精子。优缺点：制备时间较短，但是器材来源和成本较高，未广泛应用。（3）哌可密度梯度离心：根据形态正常的精子密度高于异常，经平衡离心后，形态正常的精子将聚集于高密度的哌可区域，从而分离得到高收精力的正常精子。常用哌可密度梯度为30%和45%，平衡离心10min(300g)。优缺点：可分离高质量的精子，且精子的利用率较高，但是精子体外受精结果受哌可质量的影响（4）离心洗涤法：取0.1~0.2ml的精液置于离心管中，然后加入5~10ml的获能液或受精液，离心5min(300g)，去掉上清液后，再加入5~10ml的获能液或受精液离心洗涤一次，即可用于受精优缺点：简单，精子利用率高，但对精子没有分选作用，不宜用于精子活力差和受精力较低的精液。3.精子获能处理精子获能过程：在雌性生殖道分泌的某些物质（如淀粉酶）以及雌激素的作用下，使与精子顶体结合的去能因