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梅毒实验室诊断技术及梅毒实验室检测技术规范简介背景介绍梅毒实验室检测技术梅毒实验室检测策略探讨梅毒检测技术规范简介主要内容背景介绍051015202530351995199619971998199920002001200220032004200520062007200820092010年份发病率(1/10万)全部梅毒一期梅毒二期梅毒（一期和二期梅毒更加真实反映梅毒疫情趋势）全国梅毒流行状况卫生部于2010年6月3日下发了关于《中国预防与控制梅毒规划（2010-2020年）》中国CDC于2010年8月起草了《全国梅毒检测技术规范（试行讨论稿）》卫生部下发相关政策/规划文件主要措施：广泛开展宣传教育，普及梅毒防治知识开展综合防治，阻断梅毒传播提高监测检测质量，开展主动检测，促进梅毒早期发现提供规范化梅毒医疗服务预防和控制先天梅毒加强国际合作和应用性研究《中国预防与控制梅毒规划（2010-2020年）》梅毒实验室检测技术梅毒实验室检测的意义临床服务筛查、确定现症梅毒患者；判断疗效。梅毒筛查筛查梅毒感染者，尽早发现梅毒患者（保证安全用血预防经血传播病原体和抗体）流行病学监测掌握梅毒流行趋势；了解不同高危人群的梅毒感染率、发病率。（MSM、FSW…）概述-梅毒病原体小而纤细的螺旋状微生物长5～20μm，粗细0.2μm有6～12个规则的螺旋基本结构为一原生质的圆柱体，为两层膜所围绕行动缓慢而有规律-围绕其长轴旋转中前后移动-伸缩其圈间之距离而移动-全身弯曲如蛇行概述-传播途径性接触是主要的传染途径未经治疗的患者在感染后的1年内最具有传染性随着病期的延长，传染性越来越小到感染后2年，通过性接触一般无传染性母婴传播在妊娠7周时，梅毒螺旋体即可通过胎盘传染未经治疗者，虽已无性传播（病期2年），但妊娠时仍可传染给胎儿,病期越长，传染性越小;概述-梅毒的诊断梅毒的诊断必须依靠病史、症状及实验检查进行综合分析。梅毒的实验室检查结果对诊断有决定性意义。常用梅毒实验室检测方法病原学检测血清学检测病原学检查原理：一期、二期梅毒时，取硬下疳、扁平湿疣、黏膜斑等皮损部位组织液或淋巴结穿刺术得到的组织液，在暗视野显微镜下，光线从聚光器的边缘斜射到涂片上的梅毒螺旋体而发出亮光，从而可根据其特殊形态和运动方式进行检测。方法：暗视显微镜检查镀银染色法：梅毒螺旋体具有亲银性，可被银溶液染色直接荧光法病原学检查的临床意义病原学方法直接镜检到梅毒螺旋体，在临床可确诊梅毒，且具有快速、方便、易操作的特点。螺旋体检查是诊断早期现症梅毒的最佳方法，对于患者的早期诊断、及时治疗、预后和尽早切断传染源都有十分重要的意义。如未见到梅毒螺旋体，并不能排除患梅毒的可能性，15梅毒血清学检测方法梅毒血清学检测分类(1)非梅毒螺旋体抗原血清学试验（非特异性梅毒抗体）(2)梅毒螺旋体抗原血清学试验（特异性梅毒抗体）两类方法。问题1：为什么梅毒实验室诊断需要两类血清学检测方法？非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理梅毒螺旋体一旦感染人体，宿主迅速对螺旋体表面的脂质作出免疫应答，在3周-4周产生抗类脂抗原的抗体（反应素）。抗体主要是IgM和IgG混合抗体。未经治疗的病人，其血清内的反应素可长期存在。经正规治疗后，反应素可以逐渐减少至转为阴性。问题2：临床上非梅毒螺旋体抗原血清学试验为什么有定性和定量两种检测方法非梅毒螺旋体抗原血清学原理所有非梅毒螺旋体抗原血清试验的抗原基本成分都是一样方法包括：（1）快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)（2）甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）（3）性病研究实验室试验(VDRL)等。基本成分是心磷脂卵磷脂和胆固醇抗原抗体结合形成复合物，凝集成网状沉淀颗粒被肉眼所见上述方法的敏感性和特异性都基本相似非梅毒螺旋体抗原血清学原理VDRL试验→USR→RPR/TRUSTVDRL试验抗原组成：0.03%心磷脂0.21%卵磷脂0.90%胆固醇抗原需新鲜配制不能保存待检血清需灭活目前主要用于脑脊液检查显微镜观测结果USR试验是VDRL试验的改良抗原组成：同VDRL，另含（1）乙二胺四醋酸(EDTA)使抗原可长期保存，能维持一年；（2）含有氯化胆碱对血清能起到化学灭活的作用不必加热灭活（3）制成试剂盒使用方便RPR试验在USR试剂成分的基础上加入黑色碳颗粒作为沉淀的指示物用白色的硬纸片替代玻片血清不需要灭活不需要显微镜观测结果可作定量试验有现成的试剂盒携带方便操作简单价格便宜非梅毒螺旋体抗原血清学原理TRUST其原理和成分与RPR试验相同用红色的甲苯胺红替代了碳颗粒其余的特点均与RPR相同非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理示意图非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点1、仪器：水平旋转仪。2、定性试验加样：吸取0.05mL血清(浆)放在卡片圈中，并均匀地涂布在整个圈内加抗原：将抗原轻轻摇匀，用9号针头加1滴抗原反应：将卡片置水平旋转仪100±2r/min旋转8分钟，立即在亮光下观察结果3、定量试验稀释夜准备：在圈内加入50uL生理盐水（根据需要确定稀释度），勿将盐水涂开。加样：吸取50uL血清（浆）与各圈中盐水作系列稀释，并涂布整个圈内。下同定性试验。RPRTRUSTVDRL非梅毒螺旋体抗原血清学试验结果判断滴度：出现凝集反应的血清最高稀释倍数。非梅毒螺旋体抗原血清学试验临床意义早期梅毒（一期、二期）经足量规则抗梅毒治疗后3个月，VDRL试验抗体滴度下降2个稀释度，6个月下降4个稀释度。一期梅毒1年后转为阴性二期梅毒2年后转为阴性。晚期梅毒治疗后血清滴度下降缓慢，2年后约50%病人血清反应仍为阳性。非梅毒螺旋体抗原血清试验临床意义非梅毒螺旋体抗原血清试验方法简单、快速、敏感性和特异性较好。适用于大量人群的筛查。早期梅毒硬下疳出现1周-2周后，血清可呈阳性。经治疗后血清滴度可下降并阴性，故可作为疗效观察、判愈、复发或再感染的指征。非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点非梅毒患者的梅毒血清反应呈阳性，此现象称为梅毒血清反应假阳性。①技术性假阳性反应由于标本的保存不当（如细胞污染或溶血）、试剂质量差或过期、或实验室操作错误所造成。②生物学假阳性反应是由于患者有其他疾病或生理状态发生变化，使梅毒血清试验出现阳性非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点梅毒假阳性反应的处理技术性假阳性反应一般是由于操作错误引起的假阳性反应，经过重复试验即可除外。对生物学假阳性反应，应做TPHA（TPPA）等试验进行排除。非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点前带现象指非梅毒螺旋体抗原血清试验中，有时血清中存在高浓度的抗体时出现的弱阳性、不典型或阴性反应的结果，而临床上又象二期梅毒，此时将血清稀释后再进行试验，出现了阳性的结果，该现象称为前带现象。非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点耐血清性（血清固定）指经抗梅毒治疗后，非梅毒螺旋体抗原血清试验在一定时期内不阴转。早期的耐血清性常与治疗量不足或不规则治疗、复发、再感染或有神经系统梅毒等因素有关。梅毒螺旋体抗原血清学试验梅毒螺旋体抗原血清学试验原理梅毒螺旋体特异蛋为抗原，检测梅毒患者血中特异性抗梅毒螺旋体抗原的抗体。感染梅毒螺旋体后，一旦梅毒螺旋体抗体试验呈阳性，则患者终身阳性。梅毒螺旋体抗原血清学试验方法梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)梅毒螺旋体血球凝集试验(TPHA)梅毒酶联免疫吸附试验（ELISA）梅毒免疫层析法-梅毒快速检测(RT)荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）化学发光免疫分析法（CLIA）梅毒螺旋体蛋白印迹试验（WB）TPPA/TPHATPPA试验原理与TPHA试验基本相同。TPPA试验用梅毒螺旋体致敏明胶颗粒替代TPHA试验中致敏羊红细胞，此致敏颗粒与人血清中的抗梅毒螺旋体抗体结合，产生可见的凝集反应，具有较高的敏感性。明胶粒子为洋红色，在操作上也较为方便，出结果较快。+SheepredcellT.pallidum+SensitisedcellSensitisedcellSpecificAntibodyHemagglutinationTPPA(TPHA)试验原理示意图TPPA试验检测流程使用前将试剂盒从冰箱中取出，室温放置30分钟。在96孔U型板上编上相应的待检样本的编号。按标签标明量在冻干的致敏粒子和未致敏粒子分别加入复溶液复溶，充分溶解后使用。TPPA试验检测流程定性实验每份标本做4孔，加标本稀释液至U型反应板，第1孔100µl，第2～4孔各25µl。用移液器取血清25µl至第1孔，反复混匀后取25µl至第2孔，连续倍比稀释至第4孔，最后1孔混匀后弃去25µl。第3孔加未致敏粒子25µl，第4孔加致敏粒子25µl将微量反应板置震荡器震荡30秒。置微量反应板于有盖湿盒内，室温（15℃-30℃）静置2小时后，观察结果。TPPA试验检测流程结果报告:观察第3孔，不出现凝集为有效试验。阳性：第3孔不出现凝集，第4孔出现1+～4+凝集反应。阴性：第3、4孔均不产生凝集反应。FTA-ABS试验FTA-ABS试验是检测梅毒的“金标准”试验。其原理是将有完整形态的梅毒螺旋体作为抗原，加上用吸收剂1:5稀释过的梅毒患者血清形成抗原抗体复合物，再加入荧光素（FTIC）标记的抗人免疫球蛋白，与抗梅毒螺旋体抗体结合，形成荧光的抗原抗体复合物。在荧光显微镜下，螺旋体显出苹果绿色的荧光，即为阳性反应。FTA-ABS试验示意图及结果TP—ELISA试验原理TP—ELISA试验是用重组梅毒螺旋体抗原包被固相板条，加上梅毒血清和单克隆抗体酶标记物，形成抗原抗体复合物与酶标记物结合，用酶联检测仪判定试验阳性反应。本法可用于大规模血清检测。梅毒免疫层析快速检测方法梅毒螺旋体抗原血清试验的临床意义梅毒螺旋体试验的作用是作为证实试验，它们可以帮助确定非梅毒螺旋体试验阳性反应是真阳性还是假阳性。一旦这些试验呈阳性，则患者终身阳性。梅毒螺旋体抗原血清试验的临床意义试验特异性强，很少出现假阳性。据统计，在普通人群中，有1%的生物学假阳性发生。如系统性红斑狼疮患者血清可使FTA—ABS试验呈假阳性反应。传染性单核细胞增多症，可能由于嗜异性抗体所致，可使TPHA呈假阳性。麻风患者也可使特异试验呈阳性。梅毒螺旋体抗原血清试验临床意义作为非梅毒螺旋体抗原血清试验(如RPR等)初筛阳性标本的确证试验。梅毒患者经过抗梅治疗后，TPPA等梅毒螺旋体抗体试验试验仍可阳性，故TPPA等试验阳性不能作为疗效观察的指标。TPPA等阳性不能区分既往感染和现症感染，应结合非梅毒螺旋体抗原血清试验结果进行诊断。梅毒血清学试验结果的临床意义总汇RPRTPPATRUSTTP-ELISA临床意义VDRLTP-RT__排除梅毒（一期梅毒的早期）++现症梅毒(梅毒孕妇所生的婴儿除外)+-生物学假阳性-+早期梅毒经治疗后（早早期梅毒）先天梅毒的实验室诊断方法依据实验指标诊断查到螺旋体其抗心磷脂抗体滴度持续上升其抗心磷脂抗体滴度高于其母亲四倍检测抗梅毒的IgM特异性抗体阳性随访18个月观察抗体的变化梅毒实验室检测策略思考48非梅毒螺旋体抗原血清学试验梅毒螺旋体抗原血清学试验排除试验生物学假阳性确证梅毒螺旋体现症感染排除治愈的既往感染者确证梅毒螺旋体现症感染RPR：初筛试验TPPA：确证试验OrTP-ELISA/CLIA:初筛试验RPR：滴度测定梅毒实验室检测策略思考方法选择依据敏感性、特异性（试剂评估）操作流程（可及性）试剂的价格、结果时间（可接受性）49梅毒检测技术规范简介全国梅毒检测技术规范51第一章梅毒检测样品的采集和处理第二章梅毒血清学检测第三章梅毒病原体显微镜检测第四章梅毒病原体核酸检测第五章实验室生物安全第六章梅毒检测实验室质量管理第一章样品的采集和处理血清、血浆、全血及脑脊液:梅毒血清学检测或核酸检测皮损部位组织液、淋巴穿刺液:梅毒病原体检测或核酸检测。第二章梅毒血清学检测检测目的