PCR引物设计

一、PCR引物设计原则ＰＣＲ原理1、引物是否必须是从基因片段起始端开始？PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核酸片段，使其能有效地扩增目的DNA序列十条PCR引物的设计原则总述①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。②产物不能形成二级结构。（如何避免）③引物长度一般在15~30碱基之间。（太长和太短？）④G+C含量在40%~60%之间。⑤碱基要随机分布。⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。（引物二聚合体）⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。⑧引物5’端可以修饰。⑨引物3’端不可修饰。⑩引物3’端要避开密码子的第3位。1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。有时由于模板的复杂性而无法判断，但尽量避免和基因内部有过高的同源性哪些DNA片段可作为模板？GFP在质粒上，和GFP在基因组上？哪个作为模板，更容易得到专一的GFP片段？2.避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。3.长度寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，因为38时，最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。4.G+C含量G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。Tm温度过高过低会出现问题5.碱基础随机分布引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。6.引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。7.引物之间两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。8.引物的3’端引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，引物3′端不能发生错配。9.引物的5′端引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。一般引物要引入酶切位点一般还需要引入保护碱基10.密码子的简并如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。引物设计还要结合克隆载体的酶切位点阅读框架(尤其是要表达时，参考表达载体)引物上是不是一定要设计加上酶切位点，如果没有酶切位点，如何连接到载体上去？二、引物设计实例PREMIER5设计引物题目：设计PCR引物将Tspo基因扩增后，能用双酶切连接到pET28a（+）载体上，并要求Tspo基因能完整的表达Tspo基因序列atgactcaatcaaataataccggaatactggaaaagtttgtcaatacagtaatgggggtaaaaacagaaaatcaacaacagccttcaaatacattaatcgctactacgcaagcactggatatcagagcagttttagtttacaaactagggactatcttacaaatagcagctatgatgctggctttactgggaatggaaaaattagtaatgctgattgataaaaattctcacctgcccagttggtttagcactttattagctgtattatttttcgctttattaagtattcgttcgcgaattttttcactcttagataacacccgttctcgtaagacctatgaccaggtaatcagaccaagatgggcacctccacctttagtatttcctatagtttggatgattattgcagttttgcgggtaatttcttccgtattaatttggcagcaaatgcatcaccaatttttagcactgcctttaattttatttgtggtgcatttggctttaggagatacttggaatacgatttttactgtagaacggagattaggtgcggctgttcctgtggttattttaggcccttggttatctgctctagtagtgacggcaatttattggcaaactaatcctgtagcgggaatgattttttcgttttcttgtatctggctaactgtggctgctgtattagtatttagaatttggcaattaaatggttcagagccattgtatcctttaaaactcacaccagtggaaaaataa确定：上游引物BamHI，GGATCC下游引物HindIⅡ，AAGCTT1、先查找序列有哪些酶切位点，确定使用哪几个酶切位点，酶切位点和阅读框架方向？？2、注意克隆的基因阅读框架和载体的阅读框架保持一致，如果是用pET28b（+），该怎样调整引物。3、确定引物碱基的个数，3-4个保护碱基，6个碱基的酶切位点，15个碱基序列配对，一共25个左右。先调整premer5的flie的preferences的默认碱基长度4、要设计两条链的引物，Sense链和Anti-Sense链，注意上下游引物：Sense链是上游引物，Anti-Sense链是下游引物（如何判断）5、序列前后可以加一下NNNNNN来满足引物长度的需要，特别是酶切位点和保护碱基Why？？？？？6.选择S链来编辑引物，将酶切位点碱基设计上去，同时根据需要设置保护碱基，同时注意平衡GC含量7.查看Hairpin、Dimer、FalsePriming、CrossDimer、GC含量等处，调整和编辑引物8.选择A链来编辑引物，则先将浮框拉至最右边，再进行编辑引物9.查看Hairpin、Dimer、FalsePriming、CrossDimer、GC含量等处，反复调整和编辑引物，直至获得满意的结果以上是模板较单一的基因引物设计方法如果是从基因组上克隆单个基因，则最好能知道基因上下游序列，如克隆FremyelladiplosiphonCpeB上的基因，可以使用引物搜索功能，提高引物设计的准确性