现代生命科学与生物技术-09干细胞工程

1Stemcellengineering第九章干细胞工程29.1概述9.2干细胞体外培养技术9.3干细胞治疗及临床应用9.4干细胞工程展望本章内容3利用干细胞工程技术有可能实现：•完美地修复或替代人体组织、肢体或器官的伤残•根治恶性肿瘤、帕金森病、中风等疾病9.1概述概述41896年，E.B.Wilson首次使用干细胞名词1961年Till和McCulloch首先描述了造血干细胞的特征1967年，美国华盛顿大学的多纳尔·托马斯开拓了干细胞临床应用的研究1981年，英国剑桥大学的Evans和Kaufman建立了胚胎干细胞系9.1.1干细胞研究的进展概述51998年11月，美国威斯康星大学的Thomson和Shamblott成功地使人类胚胎干细胞在体外生长和增殖1999年3月，美国科学家Goodell发现小鼠肌肉组织干细胞可以横向分化为成血细胞。2001年11月25日，美国马萨诸塞州先进细胞技术公司培育出人体早期胚胎概述62002年2月，麻省理工学院科学家首次用人体ES细胞培育出毛细血管随后的3～5年期间，各国的科学家们进一步致力于诱导胚胎干细胞分化、成体干细胞的“横向分化”方面的课题概述7目前，科学家已经试图将一些正常的体细胞直接转化为诱导多能性干细胞（iPCs），它们具有类似胚胎干细胞（ES）的功能。2007.11.20日本京都大学Yamanaka和美国威斯康辛大学JamesThomson，宣布成功把人体皮肤细胞改造成类似胚胎干细胞的“万能细胞”。概述89.1.2干细胞工程的重要性及意义重要性1999年12月美国《科学》公布干细胞研究的新发现荣登“世界十大科学成果”之首2000年再入选《科学》评选“世界十大科学成果”2001年末《科学》将干细胞研究列为2002年六大热门科技领域榜首。概述92003年《自然》《科学》分别将老鼠的胚胎干细胞中产生出精、卵细胞列为十大科学进展第4和第7位。2007年《自然》和《科学》将将体细胞“返老还童”变成胚胎干细胞的研究结果，分别列为当年十大重要发现之一《时代杂志》甚至将上述实验结果列为2007年重大发现之首!概述10•意义组织、器官移植的新来源：研究发现，取自胚胎或骨髓的干细胞可用于培养不同的人体细胞、组织或器官，这有望成为移植器官的新来源。攻克某些重大疾病的根本措施组织、器官移植可望成为21世纪人类攻克某些重大疾病，如心脑血管疾病、癌症、老年性疾病等的根本措施。概述11重建或修复组织器官的种子细胞已有临床实验证明，干细胞是重建或修复病损或衰老组织器官功能的理想种子细胞,对白血病、癌症、严重免疫性疾病以及心血管疾病、糖尿病、早老性痴呆症和脊髓受损患者有惊人的治愈作用。概述12认识基本生命规律干细胞研究将促进科学家重新认识细胞生长、分化、生物发育机制等基本生命规律；尤其是胚胎干细胞的识别、分离、增殖、定向分化将成为细胞生物学以及整个生命科学的主攻热点。后基因组计划的关键部分之一在人类基因组框架完成之后，细胞工程或称组织工程，尤其是干细胞的研究将成为后基因组计划(postgenomepro．ject)的极为关键部分之一。概述131、干细胞的概念干细胞（StemCell，SC）是来自于胚胎、胎儿或成体内具有在一定条件下无限自我更新与增殖分化能力的一类细胞，能产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，也能产生组成机体组织、器官的已特化的细胞,同时还能分化为祖细胞。通俗地讲，干细胞是尚未发育成熟的细胞，它具有再生为各种组织、器官的潜能，医学界称其为“万用细胞”。9.2干细胞及其体外培养技术9.2.1干细胞概述14干细胞的特点（1）干细胞本身不是处于分化途径的终端（2）干细胞能无限的增殖分裂（3）干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态。（4）干细胞的两种生长方式：A.对称分裂─形成两个相同的干细胞;B.非对称分裂─由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀地分配，使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端成为功能专一的分化细胞；另一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来。分化细胞的数目受分化前干细胞的数目和分裂次数控制。15按分化潜能分类全能干细胞多功能干细胞单功能干细胞具有形成完整个体的分化潜能。例：胚胎干细胞→可无限增殖分化为全身200多种细胞类型→形成机体的所有组织、器官具有分化出多种组织细胞的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力。例：骨髓多能造血干细胞→可分化出至少12种血细胞只能向单一方向分化，产生一种类型的细胞。例：肌肉中的成肌干细胞2、干细胞的分类概述16按发生学来源分类胚胎干细胞成体干细胞造血干细胞骨髓间充质干细胞神经干细胞肝干细胞皮肤表皮干细胞等等正常情况下处于休眠状态，在病理状态或外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新的能力。概述171）形态和生化特征细胞核溶酶体内质网高尔基体微丝微管质膜线粒体中心体动物细胞模式图概述18形态：细胞体积较小，通常呈圆形或椭圆形，核质比例较大。细胞核染色质分布较弥散，核仁较明显。细胞质内除含有游离核糖体外，其它细胞器均少且小。根据形态学特性和存在的位置可以辨认不同的干细胞。概述19生化特征：不同种类的干细胞生化特征有所差异，都有较高的端粒酶活性，具有较强的增值能力。不同干细胞具有各异的生化标志。实验证明，干细胞生存的微环境可以影响其形态和生化特征。概述20干细胞通过两种有丝分裂方式进行繁殖：概述3、增殖21有丝分裂周期G0期：休眠期G1期：DNA合成前期S期：DNA合成期G2期:DNA合成后期M期：有丝分裂期G0G1G2SM概述22有丝分裂23对称分裂→两个相同的（干/分化）细胞非对称分裂→一个干细胞一个祖细胞→分化细胞→成熟细胞概述3、增殖干细胞通过两种有丝分裂方式进行繁殖：24细胞分离指将组织材料分散制成细胞悬液后，从中获取目的细胞的过程。细胞纯化从原代培养成分混杂的异质性细胞悬液中或者从培养物中获得单一类型的细胞的过程。2、干细胞的分离纯化干细胞体外培养技术25细胞系（细胞株）通过细胞分离和纯化过程，使得培养物成为单一型培养物，甚至是遗传特性完全一致的培养物，称为细胞系。干细胞体外培养技术26细胞分离纯化常用方法有：1、利用细胞体积和密度，这是基于沉降作用原理，通过离心等方法，将沉降速度不同的细胞分开。2、选择性的细胞凝集，加入某种絮凝剂或物理处理的方法，使某种细胞凝集，加速沉降出去。3、基于不同粘附特性，某些细胞的基本生物学特性之一是粘附于某些固体物质，根据细胞粘附能力强弱来分离。4、利用细胞表面标志，这是一种抗体介导的细胞分离技术，选择某种单克隆抗体特异性亲和吸附分离。干细胞的分离纯化干细胞体外培养技术27液氮保藏法原理：细胞在-130℃下代谢作用停止。液氮的温度可达-196℃，可使细胞的代谢活动停止，化学作用消失。保护剂：防止细胞破裂甘油二甲基亚砜(DMSO)3、干细胞的冻存与复苏干细胞体外培养技术28干细胞的体外培养即将上述从机体的组织中分离纯化得到的单个干细胞，给予必要的生长条件，模拟动物体内生长环境，使其在体外继续生长和繁殖。9.2.3干细胞的体外培养条件干细胞体外培养技术29（1）营养要求：氨基酸、碳水化合物、维生素及一些无机离子、生长因子等。（2）环境条件：温度：哺乳动物细胞适宜的体外培养温度为35～37℃，一般控制37±0.1℃。体外培养条件干细胞体外培养技术30渗透压：多数细胞有一定的耐受渗透压能力，可在培养基配制时加以控制。气相：需要有氧条件，氧分压维持略低于大气状态，此外，还需CO2。pH：各种细胞对pH要求不尽相同，多数细胞pH7.2～7.6间生长良好。环境无毒和无菌：对培养用的容器清洗和消毒，对培养基除菌及灭菌。以防止真菌、细菌及支原体的污染。干细胞体外培养技术311、基本方法悬滴培养法培养瓶培养法旋转管培养法灌注小室培养法培养板培养法9.2.3干细胞培养的基本方法及体外培养类型干细胞体外培养技术32悬浮培养指细胞在培养皿中自由悬浮生长的过程。用于非贴壁依赖型细胞。贴壁培养必须黏附在固体介质表面上生长的细胞培养。固定化培养（微载体培养系统）即适用于贴壁依赖型细胞,又适用于非贴壁型依赖性细胞的包埋培养方式。2、体外培养类型干细胞体外培养技术331、何谓造血干细胞（HSC）血液中血细胞淋巴系细胞髓系血细胞B淋巴细胞T淋巴细胞单核巨噬细胞粒细胞巨核细胞红细胞9.3干细胞治疗及临床应用9.3.1造血干细胞34一个成年人含有2.5×1013个红细胞每一个红细胞平均寿命为120天（107秒）相当于机体每秒需产生2.5×106个红细胞这些成熟的血细胞是如何产生？干细胞治疗及临床应用35所有血细胞均来自于一个共同的始祖细胞——造血干细胞（HSC）即：造血干细胞→造血祖细胞→前体细胞→成熟血细胞造血干细胞定义是一小群具有高度的自我复制和多向分化潜能的最原始的造血细胞。干细胞治疗及临床应用36（1）在体内终身生存，数量和质量保持不变，移植后可永久重建造血；（2）兼有向髓系和淋巴系多向分化的潜能，即重建造血的同时重建免疫。造血干细胞的功能干细胞治疗及临床应用37一个造血干细胞→分裂为两个子细胞一个自我更新——保持机体内干细胞数量相对稳定另一个多向分化→→→成熟血细胞直至衰老死亡造血干细胞采用不对称的分裂方式造血干细胞的分裂方式干细胞治疗及临床应用38骨髓外周血脐带血胎儿造血系统胚胎干细胞和胚胎生殖细胞造血干细胞的来源干细胞治疗及临床应用39•血液系统病•实体癌•免疫缺陷性疾病•遗传性疾病•自身免疫性疾病等的支持治疗•免疫治疗•替代疗法•基因治疗2、造血干细胞的临床应用干细胞治疗及临床应用40异基因移植自体移植重症再生障碍性贫血急性淋巴细胞性白血病（部分亚型）慢性髓性白血病二次CR的霍奇金病首次CR的急性髓性白血病（50岁）二次CR的非霍奇金淋巴瘤骨髓发育不良（50岁）多发性骨髓瘤首次CR的急性淋巴细胞性白血病（部分亚型）实体瘤（如神经母细胞瘤等）重症遗传性免疫缺陷病二次CR的急性白血病既定的适应症地中海贫血多发性骨髓瘤自身免疫性疾病（如系统性硬化病）镰状细胞贫血慢性淋巴细胞性白血病骨硬化病急性髓性白血病遗传性代谢性疾病实体瘤（如乳腺癌、卵巢癌等）霍奇金病慢性髓性白血病非霍奇金淋巴瘤首次CR的霍奇金病新确定的适应症首次CR的非霍奇金淋巴瘤慢性淋巴细胞性白血病淀粉样变性肾细胞癌其他实体瘤实验性应用乳腺癌青年期类风湿性关节炎表1造血干细胞移植适应症41造血干细胞提取(外周)首先为捐献者注射4至5天药物“动员剂”，将骨髓中含有的大量造血干细胞动员入血液，然后从捐献者手臂静脉处采集全血，通过血细胞分离机提取干细胞，同时将其它血液通过另一手臂静脉输回体内。一次捐献后1至2周即可恢复42血癌包括：急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、何杰金病、多发性骨髓瘤和非何杰金淋巴瘤。传统的治疗方法：放疗、化疗杀伤正常骨髓细胞骨髓移植来源受限干细胞治疗及临床应用（1）治疗白血病和淋巴瘤43(自体)干细胞移植法√先用大剂量的放、化疗将骨髓中癌变造血细胞摧毁√取病人本身少量的正常的干细胞在体外大量扩增√再将其移植至病人骨髓中√正常的干细胞在病人体内自我更新√并且分化出各种所需的正常血细胞病人完全康复！干细胞治疗及临床应用44遗传性血液病包括：各种遗传性贫血（不能生成红细胞），先天性代谢失调（关键酶缺失），如：再生障碍性贫血、β-地中海贫血、骨髓石化症等。利用干细胞移植法：（1）异基因HSC移植免疫排斥（2）自体HSC的遗传修饰补充缺陷基因的功能（2）治疗遗传性血液病干细胞治疗及临床应用45放、化疗的目的在于杀灭快速增殖的癌细胞，但同时也杀灭了快速增殖的正常HSC。利用干细胞移植法：（1）自体干细胞骨髓移植以补充被杀灭的HSC；（2）从放、化疗前动员的外周血中采集HSC并储存，化疗后将这些细胞重新注入该病人体内。（3）癌症放、化疗后造血干细胞的恢复46AD包括：溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、牛皮癣等。利用干细胞移植法：使用大剂量