现代生命科学与生物技术-08细胞克隆技术

现代生命科学与生物技术第8章动物克隆化工学院生物工程系黄磊繁育与生殖•自然生殖•人工生殖，又称人类辅助生殖技术，是指利用现代医学的最新成果用人工的手段代替自然生殖过程的一部分或者全部的技术。人工生殖技术无性生殖（克隆）有性生殖人工授精体外受精代孕母亲同源人工授精人工生殖技术的分类一、概述1、“克隆”的来源•希腊语“Klone”，意思是用嫩枝来繁殖；•英语“Clone”，译音为“克隆”，意思是无性繁殖。一、概述2、细胞克隆的含义：细胞克隆是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同，从而决定了每个细胞由基因所控制的性状是彼此相同。一、概述3、细胞克隆的延伸由于上一代和下一代的遗传信息是一致的，所以简单的说，细胞克隆是生命的全息复制。时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡来自一个祖先，经过无性繁殖出的一群个体，都叫“克隆”。二、克隆技术的发展细胞克隆技术在现代生物学中被称为“生物放大技术”，它已经历了三个发展时期：第一个时期：胚胎细胞克隆阶段第二个时期：同种体细胞克隆阶段第三个时期：异种体细胞克隆阶段第一个时期：胚胎细胞克隆阶段1938年，德国胚胎学家汉斯·斯伯曼首次提出动物细胞克隆的设想。1952年，美国科学家布雷格斯和金运用汉斯·斯伯曼的构想，克隆了蝌蚪。1981年，IIImensee和Hoppe报道他们获得了克隆小鼠，这是在哺乳类第一次用胚胎细胞进行核移植获得成功。第一个时期：胚胎细胞克隆阶段1983年，美国科学家利用核移植技术结合细胞融合方法获得了克隆小鼠，此项工作真正拉开了哺乳动物克隆的序幕。1984年，丹麦科学家斯丁·维拉德森成功利用胚胎细胞克隆出一只绵羊，这是首次证实的通过核移植技术克隆哺乳动物。第一个时期：胚胎细胞克隆阶段1986年，英国的Willadsen首次应用电融合的方法克隆出一只小羊。此后,其他科学家也相继成功地克隆出小鼠、绵羊、牛、兔、猪和猴等。我国科学家也在20世纪90年代成功开展了胚胎细胞克隆兔、山羊、小鼠、牛和猪等研究。第二个时期：同种体细胞克隆阶段1997年2月，英国罗斯林研究所Wilmut等人宣布，他们用6岁成年羊的高度分化的乳腺细胞进行了核移植，成功地获得了克隆羊“多莉，Dolly”。1998年5月，美国科学家Robl的研究组利用胎儿成纤维细胞克隆出了3头牛，而且携带了转移的基因。第二个时期：同种体细胞克隆阶段1998年7月，日本科学家Dato等用牛的输卵管细胞克隆出了8头小牛。1998年7月，美国夏威夷大学Yanagimachi领导的研究小组获得小鼠卵丘细胞进行克隆再克隆小鼠成功的结果。第二个时期：同种体细胞克隆阶段1999年6月，Yanagimachi的研究小组又利用成年雄性小鼠尾尖的成纤维细胞为供核体细胞成功地克隆出了一只雄性小鼠。此后，同种体细胞克隆山羊、猪、猫、兔和狗也都相继诞生。我国体细胞克隆山羊和克隆牛不论雌的还是雄的也都已获得成功。第三个时期：异种体细胞克隆阶段异种体细胞克隆是将一种动物的体细胞核移植到另一种动物的去核（遗传物质）卵母细胞中。由于濒危物种的个体数量少，很难提供用于克隆的卵母细胞和代孕受体，这就促使科学家提出了异种克隆的设想。三、细胞学说（1）细胞：“细胞学说”：所有生物都是由一个或多个细胞组成；细胞是生命的基本单位；新细胞是从原有细胞（分裂）而来。（2）原核细胞与真核细胞：原核细胞真核细胞代表生物细菌真菌、植物、动物细胞核无有DNA环状，细胞质中线状，细胞核中细胞分裂二等分裂有丝分裂、减数分裂细胞组织不形成细胞组织形成细胞组织三、细胞学说三、细胞学说（3）细胞分裂、增殖与细胞分化：细胞分裂：是指一个细胞分裂产生两个细胞的过程；三、细胞学说（3）细胞分裂、增殖与细胞分化：细胞分裂：细胞分裂的方式：无丝分裂：有丝分裂：减数分裂：三、细胞学说（3）细胞分裂、增殖与细胞分化：细胞分裂：细胞分裂的方式：无丝分裂：原核细胞为主；三、细胞学说（3）细胞分裂、增殖与细胞分化：细胞分裂：细胞分裂的方式：有丝分裂：真核细胞为主；真核细胞的有丝分裂•大多数真核生物是多细胞生物。•体细胞的分裂称为有丝分裂；生殖细胞形成过程中，则有与之不同的减数分裂。（1）细胞分裂周期•细胞从前一次分裂开始到后一次分裂开始，这段时间称为一个:细胞周期。细胞周期通常,细胞周期可以区分为四个阶段：M期——分裂期，在这个阶段可以在显微镜下看到细胞分裂过程。G1期——S期——DNA合成期G2期——G1期，S期和G2期又总称为:分裂间期。（2）有丝分裂过程•前期:染色质浓缩，折叠，包装，形成光镜下可见的染色体，每条染色体含两条染色单体。•中期:核膜消失，染色体排列在赤道板上。•后期:姐妹染色单体分开，被分别拉向细胞两侧。•末期:重新形成核膜，染色体消失。•细胞质分裂:胞质形成间隔，最终分开为两个细胞。分裂间期前期前期末中期后期末期细胞质分裂（3）染色质和染色体•处于分裂间期的细胞，细胞核内的DNA分子，在一些蛋白质的帮助下，有一定程度的盘绕，形成核小体。多个核小体串在一起形成染色质。所以，染色质是在细胞分裂间期遗传物质存在的形式。核小体和染色质•核小体直径10nm，光镜下看不到。•当细胞进入M期时，染色质折叠包装，大约压缩8400倍。形成光镜下可以看到的染色体。•应记住，在染色体出现时，细胞已经过S期完成DNA复制，已由原来的每个DNA分子复制出两个DNA分子。所以，每条染色体由两条姐妹染色单体组成。•通常把体细胞称为双倍体细胞，体细胞的遗传物质的总含量为2n。在细胞分裂中，在光镜下可以看到染色体时，已经过DNA复制，这时遗传物质的总量已经是4n了。细胞分裂完成时，出现的两个子细胞又都回复为2n。•不同物种的细胞，染色体数目不同。所以，染色体数目也是不同物种细胞的特征。因为，对大多数物种来说，体细胞是2n的，所以染色体数目通常为偶数。物种染色体数目物种染色体数目人46豌豆14小鼠40玉米20爪蟾36小麦42果蝇8酵母32三、细胞学说（3）细胞分裂、增殖与细胞分化：细胞分裂：细胞分裂的方式：减数分裂：生殖细胞为主；真核细胞的减数分裂（1）减数分裂发生在产生生殖细胞的过程中。生殖细胞包括卵细胞和精子细胞。它们的遗传物质总量仅为体细胞的一半，称为n细胞。由2n的体细胞产生n的生殖细胞，需要经过减数分裂。（2）减数分裂后，细胞中染色体数目减少一半•减数分裂可以分为两个阶段：•第一次减数分裂：DNA复制一次，细胞分裂一次。•第二次减数分裂：DNA不复制,细胞再分裂一次。•结果，子细胞染色体数目减半，遗传物质总量由2n变为n。•总之，减数分裂就是DNA复制一次，细胞连续分裂两次，结果由一个2n细胞分出4个n细胞。（3）减数分裂丰富基因组合•减数分裂的特点:•一是子细胞染色体数减半;•二是子细胞基因组合大为丰富。•基因组合的丰富由两个原因造成。•首先，体细胞的染色体实际上是由两套同源染色体组成。人的细胞有46条染色体，实际上可以看作22对同源染色体加上两条性染色体。人的体细胞染色体在减数分裂的第一次分裂时，每对同源染色体分别分配至两个子细胞。于是父源的同源染色体和母源的同源染色体以不同组合，分配到两个子细胞中去。这样，产生不同染色体组合的配子种型大增。其次，在第一次减数分裂中，还发生同源染色体配对，配对后还发生同源染色体之间的染色体交叉和基因重组。这使基因组合状况更为复杂化。同源染色体配对和染色体交叉,造成基因重组染色体交叉的电镜图•所以，经由减数分裂产生的生殖细胞，其基因组合表现极大的丰富和多样化。结果是,有性生殖的后代具有更丰富的基因组合，具有更强的适应性和进化潜能。三、细胞学说（3）细胞分裂、增殖与细胞分化：细胞增殖：是指细胞通过生长和分裂使细胞的数目增加，使子细胞获得和母细胞相同的遗传特性。例如：皮肤细胞的更新三、细胞学说（3）细胞增殖与细胞分化：细胞分化：是指由同一母细胞产生的同源细胞，在形态和功能方面发生稳定性差异的过程。例如从受精卵母细胞逐步分化为各种组织细胞等。三、细胞学说（4）细胞分化潜能的探索：植物细胞的全能性：胡萝卜的分化实验；•对于植物来说，分化成熟的植物细胞体，仍保持全能性，仍有可能发育成完整植株。三、细胞学说（4）细胞分化潜能的探索：动物细胞的全能性：高度分化的动物细胞是否具有全能性？受精卵细胞→胚胎细胞→干细胞→体细胞对于动物来说：随着分化的演进，细胞逐渐丧失其分化潜能。全能性多能性单能性分化成熟的体细胞。实际上，动物细胞丧失全能性的过程，开始得很早。三、细胞学说（5）细胞分化的潜能：全能细胞：多能细胞：单能细胞：三、细胞学说（5）细胞分化的潜能：全能细胞(Totipotentcell)：是指一个单细胞具有能分化衍生出整个有机体的各种组织器官的潜能，例如受精卵细胞、植物细胞等。三、细胞学说（5）细胞分化的潜能：多能细胞(pluripotentcell)：是指一个单细胞具有能分化衍生出多种表型的潜能，例如多能造血干细胞。多能造血干细胞血小板红细胞淋巴细胞粒细胞三、细胞学说（5）细胞分化的潜能：单能细胞：是指一个单细胞只能具有分化为一种细胞的能力，例如单能生血干细胞。血小板红细胞淋巴细胞粒细胞单能生血干细胞单能生血干细胞单能生血干细胞单能生血干细胞人类生产四胞胎的几率为1/7x105上海的四胞胎诞生三、细胞学说（6）细胞分化的机理：A、细胞分裂的不对称性；B、细胞间的相互作用；C、细胞核与细胞；2008年十大科学进展---细胞再编程卵细胞具有一定极性，并把这种极性分为南极（动物极）和北极（植物极），细胞核靠近北极。母体物质主要储存在植物极。由于分化细胞中母体物质的不均匀分配而使其从动物极或植物极分化出来的细胞表现出不同的分化能力和分化方向。细胞分裂的不对称性某一种细胞进行分化时，不仅受到自身所含有物质的调控，也同样受到相邻细胞的影响，或者受较远的细胞所分泌的物质的影响。因此，细胞与细胞之间的相互影响也是细胞分化的重要控制因素。细胞间的相互作用对生物体细胞而言，其表现的生物学特征都会受到细胞核内遗传物质的控制。染色体的变化或特定基因的变化都可能导致细胞表型的变化。因此，综合起来细胞分化是由于各种细胞各自表达不同基因的结果，一部分基因关闭，另一部分基因打开，也包括基因表达强度的改变，从而产生不同蛋白质的表达。细胞核与细胞分化成熟的动物细胞已失去全能性。不可能发育成为完整的动物个体。原因何在？陆续出现一些探索动物细胞全能性丧失原因的实验。Illmensee&Hoppe的克隆小鼠实验细胞核受体细胞核供体收集受精卵去核融合甲品种小鼠乙品种小鼠收集囊胚期细胞团分散成单细胞取核融合将核注入已去核的受精卵中在培养皿中培养至细胞团植入假母子宫产出小鼠核移植小鼠（克隆小鼠）长成成鼠，呈核供体小鼠性状以上实验得出的结论囊胚阶段的细胞乃至成熟的体细胞，其细胞核仍具有全能性——可能发育成完整个体。细胞核保持着全套基因组。看来，关键在于细胞质。细胞质中有着决定细胞分化全能性的物质，称为分化决定子。四、动物克隆技术1、动物克隆技术的概念：动物克隆技术，是指通过无性繁殖由一个细胞产生一个和亲代遗传性状一致，形态非常相像的动物。1997年2月，英国罗斯林研究所成功地获得了克隆羊“多莉”。这是第一次从体细胞获得克隆动物，是动物克隆技术的一个里程碑，从而全世界开展了克隆动物的热潮。•1997年2月24日，•英国《泰晤士报》•披露了一条重大科•技消息：世界上第•一只通过无性繁殖•培育的“克隆羊”•7个月前就已经诞•生了。Dolly与它的“父亲”—罗斯林研究所伊恩•威尔穆特博士1997年《自然》杂志刊登研究结果四、动物克隆技术2、动物克隆技术采用的主要方法：目前，动物细胞克隆的方法主要有两种：胚胎分割：细胞核移植：四、动物克隆技术2、动物克隆技术采用的主要方法：胚胎分割：胚胎分割(embryosplitting)是运用显微操作系统将哺乳动物附植前胚胎分成若干个具有继续发育潜力部分的