L5_液相色谱常见问题分析

高效液相色谱法概论液相色谱常见问题分析HighPerformanceLiquidChromatographyconspectus2007EliteCorporation逻辑判断—将会节省解决问题的时间色谱问题的可能根源•流动相•进样器•在线过滤器•色谱柱•检测器•样品•泵•保护柱•连接管线及接头•软件•其它偶然因素2007EliteCorporation观察色谱图--尝试对问题进行分类简化问题--最先对最容易的部分进行故障排除机械因素解决色谱问题的策略•色谱柱•保护柱•流动相•样品/样品瓶问题•泵•进样器•检测器•数据采集•谱带展宽/连接问题化学因素2007EliteCorporation判断故障与故障排除的原则•规则一∶确认问题至少发生两次以上。如果问题不重复出现，很难证实其确实是问题•规则二∶从最简单的因素入手•规则三∶一次只变化一个因素，以使你能够确认所变因素与问题之间的关联2007EliteCorporation判断故障与故障排除的原则•规则四∶恢复原状。如果使用更换组件方法来查找问题之所在,完毕后应将原有完好组件安装回原处。否则,换下的组件将来很难再利用,会造成浪费•规则五∶养成记录的好习惯。一个完整的好记录是成功地进行故障排除的关键2007EliteCorporationHPLC实验中常见问题分类•HPLC系统压力问题–压力高–压力低或没有压力–压力不稳•流路基线噪音问题–基线不稳定(不重复)–长、短程振荡–基线漂移–噪音脉冲尖刺2007EliteCorporation关于色谱系统的反压什么是反压(backpressure)–流动相流经管路及色谱柱时会有阻力,即所谓的反压,又称系统反压或系统压力–Waters习惯用的压力单位是Psi(磅/平方英吋)–其它单位有:Bar,Mpa(1Bar=0.1Mpa=14.5Psi)影响系统反压的主要因素:–流动相的溶剂组成–温度–流速2007EliteCorporation压强单位换算1MPa=106Pa=10bar=145Psi1bar=0.1MPa=14.5Psi2007EliteCorporation反压与溶剂组成的关系Pressurevs.Organic-WaterPercentage02004006008001000120014001600020406080100PercentOrganicSolventpsiMeOHACN流动相的粘度是产生反压的主要原因有机溶剂－水的粘度随组成而改变其压力随组成变化如下图所示2007EliteCorporation反压与流速的关系流速对反压的影响是线性关系流速增加，反压亦增大下图的实验条件：–2.1×30mmSymmetryC18柱,20℃Pressurevs.FlowRateat20?C05001000150020002500300035004000450050000.00.20.40.60.81.01.2mL/minpsi50%MeOH50%ACN100%H2O100%MeOH100%ACN2007EliteCorporation反压与温度的关系温度对反压的影响是反比关系温度升高,反压降低,对某些流动相的影响更大一些Pressurevs.Temperature050010001500200025003000350040004500500010.020.030.040.050.060.070.0Degrees,Cpsi50%MeOH50%ACN100%H2O100%MeOH100%ACN2007EliteCorporation影响系统反压的其它因素反压与色谱柱长度成正比反压与填料颗粒度的平方成反比–2.5μm填料比3.5μm填料反压高反压与管路直径的四次方成反比(1/D4)反压与管路的长度成正比2007EliteCorporationHPLC系统压力问题分析(1)•问题:系统压力高•可能的原因:温度太低流速太高流动相粘度大管路堵塞仪器或色谱柱堵塞压力传感器问题2007EliteCorporation•问题:压力低或没有压力•可能原因:温度太高;流速太低泵关闭或保险丝断了泵未输送流动相系统内有渗漏处所用溶剂不正确HPLC系统压力问题分析(2)2007EliteCorporation•问题:压力低或没有压力•可能原因:（续）储液瓶中无溶剂低压限设置不当泵未正确排气溶剂入口过滤头堵入口管路中有空气泵失效HPLC系统压力问题分析(2)2007EliteCorporation•问题:压力不稳•可能原因:压力传感器问题泵排气不充分泵失效流动相未正确脱气所用溶剂不混溶或易挥发HPLC系统压力问题分析(3)2007EliteCorporation•基线不稳定(不重复)检测池中有大的气泡流路中有小气泡流过系统未稳定或未达到化学平衡流动相被污染检测器流动池漏色谱柱污染HPLC流路基线噪音问题分析2007EliteCorporation•基线漂移系统不稳或未化学平衡温度波动流动相未正确脱气流动相被污染;流动相中有稳定剂或稳定剂变化检测器流动池漏;系统中有渗漏色谱柱污染;固定相渗漏选用不正确的检测波长(相对于溶剂)有迟流出的组分HPLC流路基线噪音问题分析2007EliteCorporation•短程振荡泵压不稳泵入口管松,弯或堵塞溶剂混合不充分检测池中有大气泡泵入口阀脏或失效泵柱塞杆密封垫磨损检测器出口溶液成滴状流入废液瓶HPLC流路基线噪音问题分析2007EliteCorporation•长程振荡温度波动溶剂被循环通过系统•噪音脉冲尖刺流路中有小气泡泵头有气泡空腔入口阀脏或失效检测池中有小颗粒物泵或检测器未正确接地HPLC流路基线噪音问题分析2007EliteCorporation无规律基线噪音•气泡-流动相脱气•气体滞留在检测器中–流动相脱气–对检测池加一定的反压•泄漏-修复泄漏，更换接头•混合问题-增加系统体积•管线阻塞–疏通管线，冲洗系统•电问题–改变电路，去除根源2007EliteCorporation有规律的基线噪音•几乎都由色谱泵引起•泵头中有气泡–做泵排气并重做溶剂脱气•单向阀脏或失效-清洗或更换之•柱塞杆密封垫漏液-更换•柱塞杆损坏-更换•混合问题-增加系统体积•电噪音-改变电路，去除根源2007EliteCorporation色谱图常见问题分类•色谱图常见问题主要有三类:–色谱峰峰形异常问题例如负峰,宽峰,肩峰,双峰,峰形不对称等–色谱图中多峰少峰问题色谱图未出峰,出峰比预想的多等–色谱峰保留时间问题保留时间不稳定等2007EliteCorporation•HPLC最常见的问题•表明目前状况并未得到最佳的色谱柱性能•变形的色谱峰会导致:–积分不准–分离度不佳–灵敏度下降色谱图峰形问题2007EliteCorporation色谱图峰形问题示例40分1234512345正常不正常1.尿嘧啶2.心得安3.萘4.二氢苊5.阿米替林2007EliteCorporation色谱峰形问题的来源•色谱柱毁坏•溶解样品的溶剂不当•第二种相互作用•色谱柱过载–质量过载–体积过载•其它柱外效应–管路连接–采样速率–时间常数2007EliteCorporation良好填装的色谱柱色谱柱状态—机械因素填料平齐2007EliteCorporation填装良好的色谱柱良好的色谱结果表明:系统、色谱柱、连接状况皆良好2007EliteCorporation峰形问题:色谱柱塌陷柱头有死体积-Channeling填料塌陷2007EliteCorporationVoids-highbackpressure,distortedand/ordoublepeaks色谱柱填料塌陷(产生死体积)所有的峰都变形！可能的原因:–振动使柱床破坏–高pH流动相使填料颗粒溶解2007EliteCorporation色谱峰形欠佳的其它原因•色谱峰形问题：展宽且拖尾的色谱峰–色谱柱进口过滤器(筛板)部分阻塞卸下接头–在线过滤器污染更换筛板–保护柱污染更换保护柱或柱芯2007EliteCorporation(Toostrong)Column:SymmetryShieldRP18,3.5μm,3.9x150mmGuardColumn:SymmetryShieldRP18,5μmTemperature:30°CMobilePhase:0.1%TFA:Methanol(60:40)FlowRate:1mL/minInj.Volume:30μLSampleIdentification1.EDDP2.Diphenhydramine(IS)3.Methadone15所有的色谱峰都变形51510Min.样品溶解在水中0.04AU123样品溶于80%MeOH及2%HAc中1230.02AU样品溶剂强度强于流动相Detection:UVat210nm化学问题:溶解样品的溶剂不当2007EliteCorporationMinutes0510152025部分色谱峰形不正常积分误差分离度降低灵敏度降低由于第二种相互作用的发生,使碱性物质峰形拖尾–酸性及中性物质峰形对称–碱性样品“拖尾”2007EliteCorporation碱性物质峰拖尾时间(分钟)50普通C18现代C18中性物质碱性物质中性物质碱性物质0pH7不同品牌色谱柱的硅醇基活性的差异pH因素2007EliteCorporation拖尾是由什么引起的?NRON1H2R3SiONaSi-H1R23++-+RRRCl-+Na+Cl-+•混合型保留机理-第二种相互作用–与键合相的疏水作用–与硅胶带电点的离子交换作用2007EliteCorporation缓冲液的pH与拖尾缓冲液pHT12342345678传统C18现代C18理想状况2007EliteCorporation色谱峰形异常问题分析(1)•所有的峰均为负峰:信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒光学装置尚未达到平衡•一个或几个峰是负峰流动相吸收本底高进样过程中进了空气离子对分离中的系统峰样品组分的吸收(RI或UV)低于流动相2007EliteCorporation色谱峰形异常问题分析(2)•所有的峰都是宽峰系统未平衡或未达到化学平衡溶样的溶剂比流动相强很多色谱柱类型或尺寸不正确色谱柱或保护柱被污染或降级温度变化对色谱柱的影响2007EliteCorporation色谱峰形异常问题分析(3)•较早洗脱的峰呈宽峰进样体积过大或样品浓度太高进样器有问题,定量环(Loop)大小不合适在线过滤器,保护柱,色谱柱或管路堵塞管路问题:内径不对或切管不正确管路连接问题:接头或锥箍不正确检测器时间常数不正确2007EliteCorporation当上样量超过一定限度时发生–注意峰起点提前进样6.25µg2Minutes分析规模上样量(6µg)获得良好的色谱峰形46AbsorbanceAbsorbance进样25mg制备规模上样量(25mg)产生质量过载的色谱峰形注意：分析与制备之色谱峰的落点位于相同保留时间24Minutes6峰展宽/浓度(质量)过载2007EliteCorporation进样体积对色谱峰形的影响500µL300µL100µL10µL峰展宽/体积过载2007EliteCorporation峰展宽/体积过载注意：色谱峰起点相同2007EliteCorporation峰展宽/体积过载6.25µg上样5µL色谱柱体积的0.625%24Minutes6Absorbance0.625mg上样500µL色谱柱体积的62.5%24Minutes6Absorbance色谱柱体积0.8mL(800µL)在弱保留处首先观察到较宽的色谱峰色谱峰位置移动至较高保留的位置正比于进样体积2007EliteCorporation峰展宽/柱外谱带展宽.009.020.040样品谱带在管线内发生了扩散连接管线内径对系统谱带展宽的影响过长的