植物组织中SOD活性、MDA含量的测定方法

植物组织中SOD活性的测定超氧物歧化酶（SOD）是需氧生物中普遍存在的一种含金属酶。它与过氧化物酶、过氧化氢酶等酶协同作用防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞系统的伤害；SOD可以催化氧自由基的歧化反应，生成过氧化氢、过氧化氢又可以被过氧化氢酶转化成无害的分子氧和水。【原理】依据SOD抑制NBT在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧的条件下极易再氧化而产生02-，02-可将NBT还原为蓝色的甲，后者在560nm处有最大吸收。而SOD作为氧自由基的清除剂可抑制此反应。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性越低，反正酶活性越高。一个酶活单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半（50%）时所需的酶量。【仪器与用具】离心机；分光光度计；进样器；紫光灯（4000Lx）；15mm×150mm试管；黑色硬质套。【试剂】①0.05mol/L磷酸缓冲液PBS（pH=7.8）提取介质50mmol/LPBS（pH=7.8）内含1%聚乙烯吡咯烷酮②130mmol/L甲硫氨酸溶液：称1.9397gMet，用PBS7.8进行溶解并定容至100ml；③750umol/LNBT：称0.06132gNBT，用PBS7.8进行溶解并定容至100ml，避光保存；④20umol/核黄素溶液：称0.0075g核黄素，用蒸馏水溶解定容至1000ml，避光保存，现用现配；⑤100umol/L的EDTA-Na2溶液：称0.0372gEDTA-Na2，用PBS7.8定容至1000ml。【方法】1.酶液提取称取植物叶片0.2g（去叶脉）于预冷的研钵中，加1ml预冷的提取介质在冰浴下研磨成匀浆，加入提取介质冲洗研钵，并使最终体积为2ml，于4℃、10000r/min离心15min，上清液即为SOD粗提液。2.显示反应取透明度好、质地相同的15mm×150mm试管4支，2支为测定，2支为对照，按下表加入试剂。混匀后，给1支对照管罩上比试管稍长的双层黑色硬质套遮光，与其他各管同时置于4000lx日光灯下反应20-30min，反应温度控制在25-35℃试剂名称用量(ml)终浓度(比色)0.05mol/LPBS溶液1.5130mmol/LMet溶液0.313mmol/L750umol/LNBT溶液0.375umol/L20umol/L核黄素溶液0.32umol/L100umol/LEDTA-Na2溶液0.310umol/L酶液0.1对照管用缓冲液0.1ml代替蒸馏水0.5总体积3.3【计算】以遮光的对照管作空白，将上述处理好的试管在560nm处比色，采用如下进行计算：V15.0VAs-ASODFWAotoSOD活性以每克鲜重酶单位表示其中，Ao——照光对照管的光吸收值；As——样品管的光吸收值；Vt——样品液总体积(ml)；V1——测定时样品用品用量(ml)；FW——样品鲜重(g)；植物组织中MDA含量和可溶性糖含量的测定【原理】MDA是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温条件下，可与TBA反应生成红棕色的三甲川（3,3,5-三甲基恶唑-2,4-二酮），在532nm处有最大吸收。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的可溶性糖，糖与TBA显示反应产物在450nm处有最大吸收，在532nm也有吸收。【试剂】10%TCA；0.6%TBA：先加少量的1mol/LNaOH溶解，再用10%的TCA定容；【方法】1.MDA提取称取1g叶片，加2ml的10%TCA于研钵中研磨，然后再加8mlTCA继续研磨，匀浆在4000r/min离心10min,上清液即为MDA粗液。2.显示反应取离心的上清夜2ml（对照用2ml蒸馏水代替），加入2ml0.6%TBA，混合后于沸水反应15min,取上清夜测定450、532及600nm处的吸光度。【计算】①可溶性糖浓度（mmol/L）=11.71D450（糖含量套用下面公式③）②MDA浓度（umol/L）=6.45×(D532-D600)-0.56×D450③MDA含量（umol/g）=2MDA浓度（umol/L）×提取液体积（ml）/鲜重（g）/1000