组化讲稿

现代组织化学技术主编：袁新初武科大医学院组胚教研室课程简介：在形态学基础上研究细胞或组织中物质的化学组成、定位、定量及代谢状态的科学。课程性质：选修课学时：18学时，其中考试2学考试形式：开卷考试第一章组织学切片技术第一节组织取材与固定一、动物的处死1、麻醉:对小动物可将浸有乙醚的棉球与小动物同时密封于玻璃容器。较大动物静脉注射4%戊巴比妥（1ml/kg体重）或腹腔内注射20%氨基甲酸乙酯（5ml/kg体重）。2、空气栓塞:较大动物如兔，用较大空针从耳静脉将空气一次推入。3、颈椎脱臼或断头:适用于小动物4、股动物放血:将动物麻醉，切开股动脉放血。二、取材所取组织细胞必须越新鲜越好，防止组织变性、挤压、破碎，组织块不宜太大，光镜标本不超过1cm×1cm×0.3cm,电镜标本约在0.5mm左右，条件允许时应低温操作（0~4℃）。冰冻切片材料取材后如不能立即进行冰冻切片则应立即用液氮速冻，-70℃或-40℃低温冰箱保存。液氮组织速冻方法：取出后，用铝箔包好，编号存入液氮罐或-70℃冰箱保存。可保存数月至数年。如短期内应用，可保存于-30℃冰箱。三、固定一)固定的意义将组织浸入某些化学试剂，使细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构和位置，这一过程称为“固定”。固定的作用在于：①保持细胞与生活时的形态相似，防止自溶与腐败。②保持细胞内特殊的成分与生活状态时相仿：③便于区别不同组织成分；组织细胞内的不同物质经固定后产生不同的折光率，对染料产生不同的亲和力，经染色后容易区别。④有利于切片：固定剂有硬化作用，使组织硬度增加，便于制片。影响固定的因素：①影响常规染色：如用福尔马林固定时，常有福尔马林色素的异常沉积。②固定造成物质损失：不同的固定剂和固定方法会引起不同程度的细胞内蛋白质、粘多糖、脂类、核酸和低分子量物质的损失，因此应根据研究目的的不同选择合适的固定剂和固定方法，以使所研究的物质损失达到最小。③组织皱缩。二）固定液（一）单纯固定液1、甲醛（formaldehyde）：是一种约有40%重量溶于水的气体，易挥发。市面上出售的为40%的甲醛水溶液，也称为福尔马林(formalin)。一般作为固定剂使用的10%的甲醛，是用水和40%甲醛（9：1）混合而成，实际上是4%甲醛。甲醛能与蛋白质中的许多氨基酸反应，如赖氨酸、精氨酸、组氨酸等。并能保存脂类和类脂体，但必须用冰冻切片法。也可固定高尔基体、线粒体，是糖的保护剂。2、重铬酸钾：橘红色结晶，具有毒性，常用其1%~3%水溶液作为固定剂。重铬酸钾常用于混合固定液，如Zenker液、Helly液、Maximov液等。3、苦味酸：黄色结晶体，是一种强酸，易燃易爆。苦味酸能沉淀一切蛋白质，穿透慢，组织收缩明显，但组织无明显硬化。对脂肪和类脂无固定作用，用乙醇溶解可固定糖类。用含苦味酸的固定液固定组织时，时间不宜超过24小时，固定后的组织应尽快放入70%酒精，并在酒精中滴加少量饱和碳酸锂水溶液或浓氨水，有助于除去苦味酸固定产生的黄色。4、升汞：一般用其5%~7%饱和水溶液作为固定剂，单独应用组织收缩显著，因此常与醋酸和铬盐配成混合固定液使用。升汞的穿透能力低，只宜固定薄片组织。对蛋白质有沉淀作用，可固定蛋白质，但对类脂和糖类无固定作用。5、丙酮：为易挥发易燃的无色液体，可与水、醇、和醚等混合。可使蛋白质沉淀，渗透力强，对核的固定差。广泛用于酶组织化学方法中各种酶的固定。（二）混合固定液：根据对组织的作用与反应，配成混合固定液，以求得补偿某试剂对组织所致的缺陷。1、Bouin液是一种常规用于外科活检标本固定的良好固定液。用于固定大多数器官和组织，固定效果好，组织细胞结构完整。细胞核着色鲜明，但细胞质着色较差。2、Carnoy液固定胞浆和细胞核，对于染色体固定佳，显示DNA和RNA效果好，也常用于糖原和尼氏体的固定。但不能保存脂类。3、Zenker液为形态学研究常用的固定液。可用于固定多种组织，使细胞核和细胞质染色较清晰。4、Helly液该固定液对细胞质固定好，显示某些细胞质内特殊颗粒有独特优越性。5、甲醛-钙液特别适用于固定脂肪组织和组织化学染色。配方：甲醛10ml，无水氯化钙1g，蒸馏水90ml。6、中性缓冲甲醛液为免疫组织化学最常用的固定液，对组织穿透性好，组织收缩小。对大多数抗原物质保存较好，对细胞膜的通透性有影响，可能使某些大分子抗原失去活性。固定时间以24小时以内为宜。第二节组织脱水、透明、浸蜡和包埋一、脱水脱水是借某些溶媒置换组织内水分的过程。一般从70%酒精开始，经80%、90%、95%酒精，尔后至无水酒精。二、透明为使石蜡能浸入组织块，组织脱水后，必须经过一种既能与酒精相混合，又能溶解石蜡的溶剂，通过这种溶剂的媒介作用，而达到石蜡浸入组织块的目的。三、浸蜡组织经透明后，在熔化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡。可分为软蜡和硬蜡，45~50℃的熔温蜡是软蜡，55~60℃是硬蜡。组织块总的浸蜡时间约3~4小时。四、包埋组织块经过石蜡浸透包起的过程称为包埋。第三节组织切片法组织切片法包括石蜡切片法、冰冻切片法、火棉胶切片法、石蜡包埋半薄切片法等。常用的切片工具包括组织切片机、切片刀和自动磨刀机等。一、石蜡切片法组织经石蜡包埋后制成的蜡块，用切片机制成切片的过程称为石蜡切片法，一般切片厚度为4~6μm。注意事项：准备充足的经过处理的清洁载玻片和恒温烤片装置；切片刀要求锋利且无缺口；组织脱水、透明和浸蜡对于切片质量都有一定影响。二、冰冻切片法将所取材的新鲜组织，经快速冷冻后再切片，因冰冻切片制作时不经各级酒精的脱水，二甲苯的透明等过程，因此对脂肪、类脂和酶的保存较好。第四节苏木精-伊红染色方法苏木精(hematoxylin)和伊红(eosin)染色方法，简称HE染色教学和科研都是用HE染色方法观察正常和病变组织的形态结构。HE染色的基本原理细胞核染色的原理：细胞核内的染色质主要是DNA，在DNA的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精硷性染料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。HE染色中二甲苯、酒精和水洗作用1、二甲苯的作用其作用是二甲苯可以溶解切片中的石蜡，以使染料易于进入细胞和组织，因为石蜡的存在妨碍水和染料进入细胞。染色后二甲苯起透明切片的作用，以利于光线的透过。2．酒精的作用是为了洗脱用于脱蜡的二甲苯，使水能进入细胞和组织中，因为纯酒精可以和二甲苯互溶，二甲苯经过二次纯酒精的洗涤完全被除去，再经过95%、80%酒精使水分逐渐进入切片。伊红染色以后的酒精由低浓度80%、90%、95%酒精向100%酒精逐渐过度是为了逐渐脱去组织中的水洗，为二甲苯进入细胞创造条件。3．水洗的作用在脱蜡经酒精处理之后，用水洗切片，使切片中进入水，才能使苏木精染液进入细胞核中，使细胞核染色。染色之后的水洗作用是为洗去未与切片结合的染料。分化以后的水洗则是为了除去分化液和脱下的染料，中止分化作用。在伊红染色之后也可以用水洗去未结合的染料，以防止大量伊红染液进入脱水的酒精中。三、分化和蓝化作用1、分化作用苏木精染色之后，用水洗去末结合在切片中的染液，但是在细胞核中结合过多的染料和细胞浆中吸附的染料必须用分化液1%盐酸酒精脱去，才能保证细胞核和细胞浆染色的分明，把这个过程称为染色的分化作用。因酸能破坏苏木精的醌型结构，使色素与组织解离，分化不可过度。2、蓝化作用分化之后苏木精在酸性条件下处于红色离子状态，在碱性条件下则处于蓝色离子状态，而呈蓝色。所以分化之后用水洗除酸而中止分化，再用弱碱性水使苏木精染上的细胞核变呈蓝色，称蓝化作用，一般多用自来水浸洗即可变蓝，也可稀氨水或温水变蓝。染色中注意事项1、脱蜡：石蜡切片必需经过脱蜡后才能染色，脱蜡前切片要经烘烤，这样使组织与玻璃片粘贴牢固。组织切片脱蜡应彻底，脱蜡不净是影响染色不良的重要原因之一。2、染色苏木精染色后：不宜在水中和盐酸酒精停顿过长，切片分化程度应在镜下观察，分化过度，应水洗后重新在苏木精中染色，再水洗分化和使切片在自来水或稀氨水中充分变蓝。新配的伊红染色快：切片染色不宜过长，应根据染切片的多少逐步延长染色时间，切片经伊红染后，水洗时间要短。3、脱水：切片经过染色后，通过各级酒精脱水，首先从低浓度到高浓度，低浓度酒精对伊红有分化作用，切片经过低浓度时间要短，向高浓度时逐步延长脱水时间，脱水不彻底可使切片发雾，在显微镜下组织结构模糊不清。4、透明与封片：石蜡组织切片染色经过脱水后必须经二甲苯处理，使切片透明，才能用树胶封片。5、在封片时：树胶不能太稀或太稠，不能滴加的太多或太少，太稀或太少切片容易出现空泡，树胶也不可太多，不要使树胶溢出玻片四周太多。