芦丁和槲皮素的化学检识 (2)

芦丁的鉴别及含量测定小组成员：陈丽、陈惠渝、黄雄、李钰川实验目的•熟悉黄酮类化合物的化学检识的常用方法•掌握芦丁紫外吸收光谱测定的方法与原理•学习用紫外分光光度法测定芦丁提取物的含量实验原理芦丁和槲皮素的化学检识1.对不同强度碱液的溶解度试验2.浓硫酸和浓盐酸反应3.Molish反应4.盐酸-镁粉试验5.FeCl3反应6.AlCl3反应实验原理•对不同强度碱液的溶解度试验：黄酮类化合物因分子中多具有酚羟基，故显酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。由于酚羟基的数目及位置不同，酸性强弱也不同。以黄酮为例，其酚羟基酸性强弱顺序依次为：7,4‘-二OH7-或4’-OH一般酚OH5-OH3-OH因此，酚羟基的数目及位置不同的黄酮类化合物酸性不同，在不同强度碱液中的溶解度也不同。实验原理•浓硫酸和浓盐酸反应：γ-吡喃环上的1-氧原子，因有未共用的电子对，故表现微弱的碱性，可与强无机酸，如浓硫酸、盐酸等生成盐，但生成的盐极不稳定，加水后即可分解。另外，黄酮类化合物溶于浓硫酸中常常表现出特殊的颜色，可用于鉴别。实验原理•Molish反应：糖在浓硫酸或浓盐酸的作用下脱水形成糠醛及其衍生物与α-萘酚作用形成紫红色复合物，在糖液和浓硫酸的液面间形成紫环，因此又称紫环反应。Molish反应可以鉴定单糖的存在。实验原理•盐酸-镁粉试验：盐酸-镁粉反应的机制过去解释为由于生成了花色苷元所致，现在认为是因为生成了阳碳离子的缘故。•FeCl3及AlCl3反应：黄酮类化合物分子中常含有下列结构单元，故常可与铝盐、铅盐、锆盐、镁盐等试剂反应，生成有色络合物。OHOOOHOOHOH实验原理OOR7OOR74'OO4'苯甲酰基桂皮酰基黄酮类化合物结构中的交叉共轭芦丁的紫外吸收光谱的测定：实验原理芦丁的紫外吸收光谱的测定多数黄酮类化合物由两个主要吸收带组成：带I在300-400nm区间，由B环桂皮酰系统的电子跃迁引起。OOOOBB实验原理•带II在240-285nm区间，由A环苯甲酰系统的电子跃迁所引起。OOOOAA实验原理OOR7OOR74'OO4'苯甲酰基桂皮酰基黄酮类化合物结构中的交叉共轭芦丁的紫外吸收光谱的测定：说明：（1）+NaOMe或NaOAc,OHONa，变为离子化合物，共轭系统中的电子云密度增加，红移另有3,4’-OH或3,3’,4’-OH时，在NaOMe作用下易氧化破坏，故峰有衰减。（2）NaOAc为弱碱，仅使酸性较强者，如7,4’-OH解离。实验原理芦丁的紫外吸收光谱测定HCl/H2OAlCl3Al3+OOOHOHOHOAl3+Al3+OOOOOHOOOOHOHHOOH（3）形成络合物的能力：黄酮醇3-OH黄酮5-OH（二氢黄酮5-OH）邻二酚羟基二氢黄酮醇5-OH邻二酚羟基和二氢黄酮醇5-OH在酸性条件下不与AlCl3络合；但不在酸性条件下，五者皆与Al3+络合；形成络合物越稳定，红移越多。（4）根据只加AlCl3和加入AlCl3及盐酸的紫外光谱吸收峰位相减的结果，可以判断邻二酚羟基的取代情况。带II(240-285nm)（苯甲酰系统）带I(300-400nm)桂皮酰系统类型说明250-285304-350黄酮类-OH越多，带I带II越红移B环3’,4’有-OH基，带II为双峰（主峰伴肩峰）328-357黄酮醇类(3-OR)352-385黄酮醇类(3-OH)245-270270-295300-400异黄酮类二氢黄酮（醇）B环上有-OH,OCH3对带I影响不大220-270340-390或340-390(Ia)300-320(Ib)查耳酮类查耳酮2’-OH使带I红移的影响最大370-430(3-4个小峰)橙酮类加入试剂带II带I说明样品+甲醇（黄酮类及黄酮醇类）250-285304-385两峰强度基本相同，具体位置与母核上电负性取代基(-OH,-OCH3)有关，-OH,-OCH3越多，越长移+NaOMeA环有-OH，红移小，无意义40-60nm（不变或增强）50-60nm（下降）有4’-OH，无3-OH有3-OH，无4’-OH有3,4’-OH或3,3’,4’-OH（衰减更快）7-OH带I，II随加NaOMe时间延长，逐渐衰减320-330nm有吸收，成苷后消失+NaOAc(未熔融)5-20在长波一侧有明显的肩峰7-OH加入诊断试剂后引起的位移及结构测定+NaOAc(熔融)40~65有4’-OH+NaOAc/H3BO35-1012-30有6,7-OH或7,8-OH(5,6-OH无)B环有邻二酚羟基AlCl3/HCl6050-6035-5517-200有3-OH有3,5-二OH有5-OH，无3-OH有6-OR无3-OH,5-OHAlCl3光谱-AlCl3/HCl光谱30-4050-650B环有邻二酚羟基A,B环皆有邻二酚羟基A,B环皆无邻二酚羟基实验原理•芦丁提取物含量的测定：•在黄酮类化合物的紫外光谱图上主要有两个吸收带:环肉桂酰系统引起的吸收带1(300)550nm)和环苯酰系统引起的吸收带2(240)280nm)。若加入铝盐,则铝离子与黄酮化合物形成稳定的配合物,带2会明显向长波方向移动(红移);在NaNO2的强碱性溶液中,其在500nm左右吸光度值最大,从而为分光光度法测定提供了可靠的依据•注意：用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH体系分光光度法测定总黄酮含量时,必须严格保证稀释定容用乙醇的浓度、试剂加入时间、显色时间等测试环节前后完全一致,否则会出现很大误差。y=10.46x+0.0147R²=0.992300.10.20.30.40.50.600.010.020.030.040.050.06吸光度Abs芦丁标准品浓度mg/ml标准曲线系列1线性(系列1)实验试剂及仪器•试剂：芦丁及槲皮素样品、稀氨水、5%NaHCO3水溶液、5%Na2CO3水溶液、1%NaOH水溶液、浓酸、浓硫酸、乙醇、α-萘酚、镁粉、1%FeCl3醇溶液、1%AlCl3醇溶液、无水甲醇、甲醇钠溶液、AlCl3无水甲醇溶液、（1：1）盐酸、无水醋酸钠、硼酸、60%乙醇、30%乙醇、亚硝酸钠溶液（1：20）、硝酸铝溶液（1：10）、4%NaOH水溶液、蒸馏水等•仪器：试管若干支、滴管若干个、移液管若干支（公用）、药匙、100ml、50ml、10ml容量瓶各一个、紫外分光光度计等实验步骤•芦丁和槲皮素的化学检识(1)对不同强度碱液的溶解度试验：芦丁槲皮素实验步骤(2)浓硫酸和浓盐酸反应：(3)Molish反应：实验步骤(4)盐酸–镁粉试验:实验步骤(5)FeCl3反应实验步骤(6)AlCl3反应•芦丁的紫外吸收光谱测定•芦丁提取物含量的测定实验步骤•芦丁的紫外吸收光谱测定：测定方法：精密称取芦丁l0mg于l00mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释到刻度，摇匀。从中吸取5mL于50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度；摇匀备用（10μg/mL)A、甲醇光谱：取样品溶液置石英杯中，200~400nm内进行扫描，重复一次，观察紫外光谱。B、甲醇钠光谱：取样品液置石英杯中，加入甲醇钠溶液3滴后，立即测定。放5分钟后再测一次。C、AlCl3光谱：在置有样品液的石英杯中加入AlCl3溶液6滴，停1分钟后进行测定。然后加入3滴盐酸(HCl:水=1:1)再进行测定。实验步骤•D、醋酸钠光谱；取样品溶液3mL，加入过量的无水醋酸钠固体，摇匀(杯底剩有少量的醋酸钠，2分钟内测定，5～10分钟后再测一次。•E、醋酸钠硼酸光谱：方法2实验步骤•芦丁提取物的含量测定：•(1)标准曲线的绘制：•(2)测定：精密称取精制芦丁20mg，置l00mL量瓶中，加60％乙醇适量，置水浴上微热使溶解，放冷，60%乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取25mL，置50mL量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即得0.1mg/mL的样品液。精密吸取样品液3.0mL置10mL量瓶中，加30％乙醇使成5mL。精密加亚硝酸钠溶液(1：20)0.3mL，摇匀。放置6分钟，再加硝酸铝溶液(1：10)0.3mL，摇匀，放置6分钟。加4％NaOH溶液4mL，用水稀释至刻度，振摇，放置l5分钟置比色皿中，在500nm波长测定吸收度。从标准曲线中读出芦丁含量。THANKSFORYOURATTENTION!!