细胞培养液的配制

细胞培养液的配制培养基的选择依据:经验、文献、尝试常用:RPMI1640、DMEM培养基的来源市售干粉培养基---自己配制液体培养基---直接使用(注意有效期)培养基的除菌方法过滤除菌:(1)正压过滤---效率高(2)负压过滤---效率低高压蒸气灭菌:不含谷氨酰胺，灭菌后另外添加培养基附加成分的添加按使用说明或实验要求添加配制时加:碳酸氢钠、抗生素、血清等临用前加:生物活性因子如EGF、FGF、NGF、PDGF等RPMI1640培养液配制过程准备物品(1)不锈钢过滤器,滤膜(0.45μm,0.22μm),磁力搅拌器,天平,烧杯,量筒,盐水瓶(2)培养粉,1NHCl,NaHCO3,青霉素,链霉素,胎牛血清,新鲜三蒸水消毒物品滤器中放置0.45μm和0.22μm滤膜,包装,高压蒸气消毒配制步骤(1)10.4g/包培养粉溶至1L三蒸水中,磁力搅拌20min(2)加2gNaHCO3/L,继续搅拌10min(3)加青霉素100U/mL(80万U溶至4ml三蒸水,取0.5ml)链霉素100U/mL(100万U溶至5ml三蒸水,取0.5ml))(4)加1NHCl约3mL,调pH至7.2,继续搅拌(5)按要求加血清（血清一般需经56℃，30min灭活）例如:10%胎牛血清无血清培养液900ml灭活胎牛血清100ml(6)正压过滤除菌(气压适当,防止滤膜破裂)(7)分装,贮存于4℃，2周内用完。(8)无菌试验:取样,37℃放置24－72h,无细菌、霉菌污染方可使用注意事项谷氨酰胺在溶液中很不稳定，４℃，７ｄ分解５０％，放置两周以上时，根据需要添加谷氨酰胺。配制１００×母液（200mmol/L,即29.22g/L）,每100ml加入0.5－2ml母液，终浓度1－4mmol/L抗生素在37℃稳定性维持3－4d,可控制轻度污染。防污染重在无菌操作培养液配制过程（以RPMI1640为例）1.物品准备(1）滤器、微孔滤膜、磁力搅拌器、天平、烧杯、量筒、pH计、贮液瓶等。(2)培养粉、NaHCO3、1NHCl、青霉素、链霉素、血清、新鲜制备的三蒸水2.滤器消毒准备取孔径为0.45μm和0.22μm滤膜各一张，浸入三蒸水中将浸湿后的滤膜光面向上依次置于滤器上将装有滤膜的滤器包装后高压蒸气消毒3.液体配制①将培养粉倒入容器中②加入新鲜制备的三蒸水磁力搅拌器充分搅拌③按照实验的具体要求分别加入NaHCO3和青链霉素（青霉素100U/mL：80万U溶至4ml三蒸水,取0.5ml；链霉素100U/mL：100万U溶至5ml三蒸水,取0.5ml)④按要求加入一定比例的血清（血清一般需经56℃，30min灭活）例如:配制含10%胎牛血清的RPMI1640培养液1升，应加入无血清培养液900ml灭活胎牛血清100ml⑤加入1NHCl约3mL,调整pH至7.2－7.4磁力搅拌器充分搅拌准备过滤⑥无菌条件下装好滤器，检查气体以及液体管道是否通畅。(一般使用氧气。注意气压适当,防止滤膜破裂，)将液体倒入无菌滤器，接通气体⑦过滤后的液体分装于贮液瓶分装过程严格无菌操作分装后的液体贮存于4℃，2周内用完。