天然产物提取方法和技术

第一节天然产物开发利用方案确定大致可分为：选定研究对象、生物材料采集和品种鉴定、文献资料调研、化学成分预试验、活性提取部位和活性化合物跟踪分离和结构鉴定、构效关系、药理、毒理、制剂工艺、临床实验、中试、正式生产等步骤。根据研究目的的不同：一、研究对象的确定根据古代医学典籍、民族医学实践提供的资料或民间经验和临床观察；根据当地植物样品随机选取；根据天然产物成分信息确定；根据已有的天然产物、医药学及相关科学研究成果的基础上，通过大量的文献检索根据市场商品要求确定研究对象。传统中医药有其丰富的医药学和文化内涵。根据古今记载的临床有效处方，收集整理临床治病的单秘验方的单味药或复方药进行研究，筛选活性天然产物。如：冬凌草冬凌草(Rabdosiarubescens(Hemls.)Hara)为唇形科香茶菜属药用植物广布于我国黄河长江流域，河南济源民间用于治疗食管癌，贲门癌的民间药物；研究发现它的有效化学成分是一个二萜类化合物，冬凌草素。活性跟踪纯化当归芦荟丸：临床具有泻肝作用；中国医学科学院用其治疗白血病，也有好效果。处方中：除去麝香后，疗效仍有；但除去青黛和芦荟后，则无一例有效；再进行小鼠筛选：发现青黛是抗白血病的活性植物。继续研究：发现青黛的有效成分为靛玉红，研制出抗慢性粒细胞白血病的有效新药。生物亲缘关系确定研究对象如：苦木苦味素类成分的研究从苦木科鸦胆子属抗痢鸦胆子（B.antidysentericaMill)植物中得到有显著抗肿瘤活性的化合物鸦胆丁；后从苦木科16属35种植物中也得到了约140个苦木苦味素类成分，其中30个有不同程度的抗肿瘤活性。鸦胆子重视那些生存环境特殊（海拔、气候、阳光、恶劣环境或其他特殊环境）的植物与天然产物提取分离有关的期刊杂志主要有：NaturalProductReport，1984年开始出版（英国皇家化学会），刊登天然产物研究方面的热点研究领域综述性文章。JournalofNaturalProduct，美国化学会与美国生药学会合办，刊登药用活性天然产物研究的原始研究论文。二、查阅文献资料和收集信息期刊杂志主要有：Phytochemistry，国际植物生物化学与天然有机化学的专业期刊，刊登天然产物、植物分子生物学等研究的原始论文。JournalofAsianNaturalProductResearch，中国与日本合办，发表亚洲国家天然产物分离、结构鉴定、合成、生物转化、生药学和药理评价方面的原始研究论文。化学文摘（C.A.)收录1967年以后的内容，可通过中国科技信息研究所（)实现检索美国化学会网站，（)收录几十种主办的化学类刊物，英国皇家化学会网站，()收录英国皇家化学会的刊物数据库主要有：天然产物生产工艺资料；生物资源、组织特性、地理分布；化学成分和质量标准等资料；有效成分体内代谢变化的资料；有效成分的结构、性质和生物活性等方面的资料；结构相似化学成分的各种研究资料等等。文献内容可包括：实验设计：1.观察项目的可比性:实验条件控制的要非常严格，否则实验结果将不可靠。同一个实验要重复多次，以观察它的精确度、重现性和可靠性。若差别较大时，还需对数据进行统计学处理，以计算它们的实验误差和可信性。三、实验设计和工艺流程的选择实验设计：2.选择测试指标：在实验中所使用的分析方法测定速度快，结果要精确可靠；三、实验设计和工艺流程的选择3.不能直接搬用植物化学的提取方法作为工业生成的方法？植物化学提取的目的：新化合物、鉴定结构、发现新成分、不计算成本、收率、经济效益；天然产物生产提取目的：要考虑收率、成本和经济效益等；在生产天然产物提取物时使用植物化学或中草药化学中的有效成分提取分离方法是不经济的，在技术上也是不行的。因此，不能直接搬用植物化学的提取方法作为工业生产的方法。仍必须大量参考有关的植物化学提取流程和被提取有效成分的结构及其物理化学性质。必要时以这些资料作为科学依据，根据这些资料做实验设计。做天然产物提取生产工艺的实验研究时，一定要从工业生产的要求和实验情况出发，*以经济的观点设计生产工艺：流程简单、经济可行，收率高、产品质量高和成本低。1.分离纯化的早期：由于提取液中的成分复杂、目的物浓度较稀、与目的物理化性质相似的杂质多，所以不宜选择分辨能力较高的纯化方法；宜采用萃取、沉淀、吸附等分辨能力低的方法有利；这些方法负荷能力大，分离量多兼有分离提纯和浓缩作用，为进一步分离纯化创造良好的基础。工艺流程中注意事项：1.分离纯化的早期：总的来说，早期分离方法的旋转原则是从低分辨能力到高分辨能力，而且负荷量较大者较为合适2.安排纯化顺序：考虑到有利于减少工序、提高效率；如：在盐析后采取吸附法，必然会因离子过多而影响吸附效果，如增加透析除盐，则使操作大大复杂化。如果倒过来进行，先吸附，后盐析就比较合理。3.分离操作的后期：必须注意避免产品的损失，主要是器皿的吸附，样品液体残留，空气氧化及无法了解的原因。为取得足够量的样品，常需要加大原材料的用量，并在后期纯化工序中注意保持样品溶液由较高的浓度，以防止制备物在稀溶液中的变性，一个制备物是否纯，常以“均一性”表示均一性是指所获得的制备物只具有一种完全相同的成分。均一性的评价需经过数种方法的验证才能肯定。纯度的鉴定方法很多，常用的有：溶解度法、结晶法、熔点法、色谱法、质谱法等多种进入新实验研究阶段：即小型或放大生产实验阶段这个阶段的主要任务：检查生产工艺流程的可行性和存在的问题，并为中间生产实验或正式工业生产提供科学依据。二、实验设计和工艺流程的选择小实验：原料用量少，使用设备以玻璃仪器为主，参加实验人少；放大实验：投料量大，设备多用小型工业设备，参加实验人多；小实验为放大实验提供数据和经验，可节约放大实验所需要的时间、人力、物力的投入。二、实验设计和工艺流程的选择进入中试前的考虑：1.产率达到一定的稳定程度，质量可靠；2.工艺路线及操作步骤确定，建立和确定产品、中间体及原料的分析方法；3.确定和鉴定产品的生物材料的资源；四、天然产物提取中试设计进入中试前的考虑：3.确定和鉴定产品的生物材料的资源；4.物料的衡算，“三废”的处理方法；5.中试规模及原料的规格和数量；6.安全生产措施和方法。四、天然产物提取中试设计天然产物提取中试放大工艺特点：中试放大是由小试转入工业化生产的过渡性研究工作，对小试工艺能否成功地进入规模生产至关重要研究工作主要围绕着如何提高收率、改进操作、提高质量、形成生产等方面进行。一个工艺研究项目的最终目的是能在生产上采用。1.原辅材料规格的过渡试验；小试时：一般采用的原辅材料规格较高。目的：是为了排除原料中所含杂质的不良影响，确保实验的准确性。大规模生产时：应改为生产时容易获得的原辅材料进行过渡性实验。转入中试放大生产的过渡性试验：2.设备选型与材料质量试验；小试阶段：大部分实验时在小型玻璃仪器中进行；中试阶段：要对设备材料的质量和设备的选型进行实验，为工业化生产提供数据。转入中试放大生产的过渡性试验：3.反应条件限度实验；目的:找到最适宜的工艺条件（如培养基种类、反应温度、压力、pH等），一般均匀一个许可范围。转入中试放大生产的过渡性试验：4.原辅材料、中间体及产品质量分析方法研究中间体和新产品均无现成分析方法，须研究他们的鉴定方法，制定简便易行、准确可靠的检验方法。转入中试放大生产的过渡性试验：5.下游工艺研究上游工艺：以生物材料资源生产为核心的研究内容；下游工艺：以产品的后处理为研究内容的操作。必须研究尽量简化下游工艺操作，采用新工艺、新技术和新设备，提高劳动生产率，降低成本。转入中试放大生产的过渡性试验：中试放大的方法：1.经验法：2.相似法：3.数学模型法中试放大的研究主要内容：1.工艺路线和各步反应方法的最后确定；2.设备材质和型号的选择；3.反应器的规模选择和反应搅拌器型式与搅拌速度的考察；4.生产反应条件的研究；5.工艺流程和操作方法的确定；中试放大的研究主要内容：6.物料衡算；7.安全生产与“三废”防治措施；8.原辅材料、中间体的物理性质和化工常数的测定；9.原辅材料、中间体质量标准的研究制定；10.消耗定额、原料成本、操作工时与生产周期等的计算。第二节原料细胞结构与提取工艺特性一、原料与天然产物提取工艺特性1.植物材料：根、茎、干果、花、叶等根：如人参、丹参等用有机溶剂乙醇浸出；茎:可用有机溶剂加热浸出干果：可用有机溶剂浸出花：是由果胶类物质组成，需用酶或发酵的方法处理后再用溶剂提取；叶：多数不用处理，直接用溶剂提取；2.动物材料与天然产物提取工艺特性角类和骨类：加工前需要粉碎细一些；皮类：应用新鲜材料，加工前先破碎；3.海洋生物材料与天然产物提取工艺特性海藻：抗肿瘤、防心血管疾病等；腔肠动物：海葵毒素；软体动物：抗病毒、抗肿瘤等；棘皮动物：海胆毒素；4.微生物与天然产物提取工艺特性细菌放线菌蓝细菌真菌（霉菌和酵母菌）二、生物细胞的结构与天然成分的浸出活性成分或有效成分存在细胞质中。细胞有：细胞壁和细胞膜细胞有细胞壁和细胞膜；细胞膜类似于半透膜，具有超滤作用，即对细胞外的物质的透过有分子筛作用，筛孔有一定的大小，透过物质的分子较小时容易透过，较大的分子不易透过；活性成分/有效成分是存在细胞质中细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶物质组成，细胞壁上有许多小孔叫孔壁，不过，不影响水溶性物质的出入；对外界物质的进入或细胞内物质的外出有决定作用的是细胞膜。活性成分/有效成分是存在细胞质中植物原料外表面如叶、果实皮、茎皮等的表面组织上有蜡浸细胞壁，是蜡浸入细胞的纤维素壁中，形成蜡层。蜡层是由蜡醇和脂肪酸组成，使得细胞壁有很强的疏水性。有效成分的提取，要设法破坏一般细胞的细胞膜，改变细胞膜的通透性，使浸出溶剂进入细胞内，并把有效成分提取出来。对有蜡浸细胞壁组织表面的原料需破坏其蜡浸细胞壁，改变细胞壁的通透性。二、生物细胞的结构与天然成分的浸出活性成分或有效成分存在细胞质中。破坏细胞膜和细胞壁，使有效成分提取出来。三、破坏细胞壁和细胞膜的方法1.风干法2.加热干燥法3.机械法4.非机械法5.化学法在通风良好不见直射阳光的条件下开始时，由于外界空气的蒸汽压或相对湿度较低，细胞壁先失水，随后细胞质的液泡也失水，细胞液的浓度增高，使涨压减低萎蔫，终致细胞破坏到死亡。失水收缩，但不产生质壁分离，是机械伤害。改变膜的超滤性和渗透性，细胞内的物质易于被溶剂浸出。风干法，对有效成分损害小；1.风干法原料的细胞组织用风干法不易破坏的，且有效成分在加热时没有重大影响的条件下，可用加热法破坏原料组织结构；a.在浸出有效成分时，使细胞质和蛋白质凝集、变性、收缩，致使细胞膜和细胞壁破坏，提高渗透性，细胞内物质迅速向外扩散；2.加热干燥法b.新鲜原料切片后加热干燥，水分急剧蒸发，细胞内原生质和蛋白质凝固、变性、细胞萎缩，破坏细胞壁和细胞膜，改变细胞组织的渗透性；不适合热不稳定性物质；2.加热干燥法处理量大，速度快，但需采取冷却措施。a.球磨法:将细胞组织悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使细胞破碎；b.高压匀浆：利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击而造成细胞破裂；压力、温度和通过匀浆阀的次数；3.机械法：处理量大，速度快，但需采取冷却措施。c.X-press法：改进的高压方法；d.超声波法：在15－25KHz频率下操作，利用超声波的空穴作用，不适用于大规模操作；3.机械法：适于微生物的破碎，包括酶解、渗透压冲击、冻结和融化、热处理和化学法溶胞等；酶解：利用酶的反应分解破坏细胞壁上特殊的键，达到破坏目的，有专一性强，条件温和的优点；渗透压冲击：渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁破裂；适用于细胞壁较脆弱的菌；冻结和融化：在低温下突然冷冻和