荧光定量PCR的原理及临床应用2(学生讲课HCMV)

荧光定量PCR的原理及临床应用苏晓霁如何做一个“聪明”的实习生实习的目的就是对在校所学的理论知识和实验技能，在临床的实际工作中进行实践、巩固和提高。如何做到：①实习之前要复习理论知识和实验课内容“理论先行”②实习过程中要“聪明”③做好实习笔记，用心思考，实习之外下功夫如何做一个“聪明”的实习生聪明耳：认真听老师的说明和讲解看：仔细看老师的操作问：有疑问要多提问，多讨论心：要用心去思考日月：要每天每月坚持做到内容概要PCR的定义和原理荧光定量PCR的原理和分类荧光定量PCR结果的分析荧光定量PCR在临床的应用PCR的定义PCR是PolymeraseChainReaction的缩写，中文称为聚合酶链式反应，由变性、退火及延伸几步反应组成一个周期,循环进行,可使目的DNA得以迅速扩增。由美国PE公司遗传部的Dr.Mullis发明，由于PCR技术的跨时代意义，Mullis获得了1993年诺贝尔化学奖。PCR的原理变性：双链DNA在高温下解开成单链的过程。温度一般为95℃左右。5’…CCACTGCCTCTC……CCTGAGCTGTGA…3’3’…GGTGACGGAGAG……GGACTCGACACT…5’5’…CCACTGCCTCTC……CCTGAGCTGTGA…3’3’…GGTGACGGAGAG……GGACTCGACACT…5’加热PCR的原理退火：温度下降后，两条配对的单链DNA重新结合为双链的过程。温度一般为50~60℃。5’…CCACTGCCTCTC……CCTGAGCTGTGA…3’3’…GGTGACGGAGAG……GGACTCGACACT…5’CCACTGCCTCTCGGACTCGACACT5’…CCACTGCCTCTC……CCTGAGCTGTGA…3’3’…GGTGACGGAGAG……GGACTCGACACT…5’CCACTGCCTCTCGGACTCGACACT降温PCR的原理延伸：DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。温度一般为72℃左右。5’…CCACTGCCTCTC……CCTGAGCTGTGA…3’3’…GGTGACGGAGAG……GGACTCGACACT…5’CCACTGCCTCTCGGACTCGACACT5’…CCACTGCCTCTC……CCTGAGCTGTGA…3’3’…GGTGACGGAGAG……GGACTCGACACT…5’CCACTGCCTCTC……CCTGAGCTGTGAGGTGACGGAGAG……GGACTCGACACT恒温普通PCR的原理普通PCR的原理PCR反应成分：1.模板DNA2.引物3.四种脱氧核糖核苷酸4.DNA聚合酶(Taq酶)5.反应缓冲液、Mg2+等6.荧光探针（荧光定量PCR）Taq酶的发现在Taq酶发现之前，实验室的PCR反应中运用的是大肠杆菌DNA聚合酶Ι的Klenow片段。Klenow酶不耐高温，90℃加热后会变性失活，每次循环结束都要加入新鲜的酶。而且DNA的延伸是在37℃完成，模板和引物容易错配，造成反应的特异性很差。Taq酶的发现美国的嗜热菌研究室在黄石国家公园温泉中发现了嗜热菌(Thermusaquaticus)株，Cetus公司研究人员从中分离了TaqDNA聚合酶特点：①耐高温：70℃2h活性90%，93℃2h活性60%，95℃2h活性40%；②延伸温度较高(一般为72℃)：大大提高了扩增特异性、灵敏性和扩增效率。荧光定量PCR概念：在PCR反应中加入荧光基团，利用荧光信号累积或变化实时监测整个反应过程，最后通过特定数学模型对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems，ABI公司推出，实现了PCR从定性到定量的飞跃。实时荧光定量PCR的原理利用荧光信号的变化实时监测PCR反应的每个循环的扩增产物量的变化。通过Ct值和标准曲线分析对起始标本的模板量进行定量分析。与普通PCR的比较普通PCR完成后，一般只对扩增的最终产物量进行分析，分析结果多为定性或者半定量结果。荧光定量PCR通过监测荧光值的变化，体现每一个循环的扩增产物量的变化，分析结果为定量结果。与普通PCR的比较普通PCR完成后，才能进行扩增产物的分析，而且分析的过程可能产生一定的生物危害和环境污染。荧光定量PCR的扩增和产物分析过程是同时完成的，而且在封闭的反应体系中进行，比较安全，易于处理。常用的名词概念本底信号（Baseline）荧光阈值（Threshold）Ct值（Ctvalue）扩增曲线前15个循环荧光信号的均值，可手动调节选择默认是第3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，也可手动调节扩增过程中，产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数常用的名词概念ThresholdBaselineCtvalue荧光强度Rn扩增循环数对数增长期实际中的运用左图为5个数量级的标准品扩增后得到的荧光曲线，右图以Ct值为纵坐标，lgXs为横坐标，可计算得出标准曲线实时荧光定量PCR的分类目前的实时荧光定量PCR均是基于荧光共振能量转移（Fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET）的原理。FQ10nmFFluorophore,荧光基团QQuencher，淬灭基团FQ10nm荧光共振能量转移（FRET）发生的条件荧光基团和淬灭基团都能发射荧光荧光基团的发射光谱和淬灭基团的激发光谱需有效重叠荧光基团和淬灭基团应足够的近（10nm）波长信号强度常见的实时荧光定量PCRTaqMan探针法实时荧光定量PCR分子信标探针法实时荧光定量PCR双链DNA交联荧光染料法实时荧光定量PCR双杂交探针法实时荧光定量PCR蝎形探针法实时荧光定量PCR探针的荧光标记探针在其5’端标记一个荧光基团，如6-羧基荧光素(FAM)、四氯-6-羧基荧光素(TET)、六氯-6-羧基荧光素(HEX)等探针在其3’端标记一个淬灭基团，如6-羧基-四甲基罗丹明(TAMRA)TaqMan探针法实时荧光定量PCR引物延伸所用到的DNA聚合酶Taq酶同时具有5’→3’方向核酸聚合酶活性，还具有对聚合延伸中遇到与靶序列结合的核苷酸序列的5’→3’核酸外切酶活性。分子信标探针法实时荧光定量PCR茎环结构的分子信标探针荧光染料法实时荧光定量PCR最常用的染料就是SYBRGreenΙ，游离时只发出微弱荧光，当它非特异性与双链DNA小沟结合后，荧光强度可增大1000倍。所以，反应中发出的荧光信号与扩增产生的DNA双链的量成正比。几种方法的比较方法优点缺点TaqMan法特异性高重复性好价格高只适合特定目标分子信标法特异性更高荧光背景低价格高只适合特定目标设计较困难荧光染料法适用性广方便、便宜引物要求高易出现非特异结果荧光定量PCR在临床的应用在实际的临床应用中，TaqMan法的荧光定量PCR比较多见。TaqMan法特异性高，重复性好，价格适中，可以满足临床上检测特定项目的要求。荧光定量PCR在临床的应用常见的异常结果：假阳性、假阴性和“灰区”如何发现异常结果：①设定阳性对照、阳性质控（低值、中值、高值）和阴性对照②加入内标试剂与标本一起扩增，帮助判断假阴性结果出现荧光定量PCR在临床的应用如何判断：标本结果为阴性，而内标荧光不随着扩增而增加，则可判断为假阴性结果阳性对照阴性对照阳性低值阳性中值阳性高值判断结果+-在控在控在控结果可靠++/-可能出现假阳性++阳性结果不可靠+/--偏低/-偏低偏低可能出现假阴性---偏低/-偏低所有结果不可靠荧光定量PCR在临床的应用出现异常结果的原因：①试剂和实验器材的原因：试剂过期失效，耗材中存在DNase、RNase、抑制物等②实验操作不当③标本间污染：相临的测试孔结果相近★④气溶胶污染：大范围的阳性结果⑤仪器故障荧光定量PCR在临床的应用有效防止和消除气溶胶污染的方法：①保持实验室的通风，最好有机械通风设备②10%次氯酸钠溶液的喷洒和擦拭③1MHCl溶液的浸泡④紫外线的照射：500bp片段敏感⑤75%或无水乙醇溶液喷雾荧光定量PCR在临床的应用在反应体系中使用dUTP和UNG酶消除以往实验的污染影响UNG酶（尿嘧啶-N-糖基化酶）：选择性水解断裂含有dU的双链和单链中的尿嘧啶糖苷键，在碱性介质和高温下会进一步水解断裂，酶的最佳活性温度是50℃，在95℃失活。荧光定量PCR在临床的应用气溶胶污染物50℃2min，95℃灭活加入UNG酶荧光定量PCR在临床的应用5’…CCACTGCCTCTC……CCTGAGCTGTGA…3’5’…CCACUGCCUCUC……CCUGAGCUGUGA…3’扩增加入dUTP5’…CCACUGCCUCUC……CCUGAGCUGUGA…3’5’…CCACUGCCUCUC……CCUGAGCUGUGA…3’5’…CCACUGCCUCUC……CCUGAGCUGUGA…3’’…CCACUGCCUCUC……CCUGAGCUGUGA…3’5’…CCACUGCCUCUC……CCUGAGCUGUGA…3’5’…CCACUGCCUCUC……CCUGAGCUGUGA…3’5’…CCACUGCCUCUC……CCUGAGCUGUGA…3’5’…CCACUGCCUCUC……CCUGAGCUGUGA…3’5’…CCACUGCCUCUC……CCUGAGCUGUGA…3’潜在气溶胶污染物50℃2min加入UNG酶5’…断裂的核苷酸片段…3’5’…断裂的核苷酸片段…3’5’…断裂的核苷酸片段…3’5’…断裂的核苷酸片段…3’5’…断裂的核苷酸片段…3’5’…断裂的核苷酸片段…3’5’…断裂的核苷酸片段…3’5’…断裂的核苷酸片段…3’5’…断裂的核苷酸片段…3’5’…断裂的核苷酸片段…3’荧光定量PCR在临床的应用乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)EB病毒DNA(EBV-DNA)人巨细胞病毒DNA(HCMV-DNA)肺炎支原体DNA(MP-DNA)肺炎衣原体DNA(CP-DNA)临床标本的采集检测项目标本类型及要求HBV-DNA血清或者血浆100μl(不可用肝素抗凝)EBV-DNA血清100μl或抗凝全血1ml(不可用肝素抗凝)HCMV-DNA血清100μl或抗凝全血1ml(不可用肝素抗凝)MP-DNACP-DNA咽拭子、痰液或肺支气管灌洗液1ml人巨细胞病毒DNA检测试剂盒用于器官移植、骨髓移植及HIV阳性/AIDS患者人巨细胞病毒感染的辅助诊断和疗效监控。临床上可以采用的标本类型：尿液、乳汁、血清、血浆或淋巴细胞样本中人巨细胞病毒DNA。人巨细胞病毒DNA检测试剂盒巨细胞病毒DNA的提取（血清或血浆）100μl血清或血浆100μlDNA浓缩液去除上清液，保留沉淀12000rpm，10min人巨细胞病毒DNA检测试剂盒巨细胞病毒DNA的提取（血清或血浆）加入50μlDNA提取液剧烈振荡混匀5-10s100℃加热10min人巨细胞病毒DNA检测试剂盒巨细胞病毒DNA的提取（血清或血浆）4℃放置或用于PCR振荡混匀5~10s12000rpm，5min人巨细胞病毒DNA检测试剂盒巨细胞病毒DNA的提取（尿液和乳汁）1ml尿液或乳汁去除上清液，保留沉淀12000rpm，5min人巨细胞病毒DNA检测试剂盒巨细胞病毒DNA的提取（尿液和乳汁）加入50μlDNA提取液剧烈振荡混匀5-10s100℃加热10min人巨细胞病毒DNA检测试剂盒巨细胞病毒DNA的提取（尿液和乳汁）4℃放置或用于PCR振荡混匀5~10s12000rpm，5min人巨细胞病毒DNA检测试剂盒人巨细胞病毒DNA的提取（淋巴细胞的提取）1ml抗凝全血1ml生理盐水0.3ml淋巴细胞分离液人巨细胞病毒DNA检测试剂盒人巨细胞病毒DNA的提取（淋巴细胞的提取）水平离心机2500rpm，15min淋巴细胞层吸取淋巴细胞悬液人巨细胞病毒DNA检测试剂盒人巨细胞病毒DNA的提取（淋巴细胞的提取）淋巴细胞悬液去除上清液，保留沉淀1200