DNA测序 化学降解法

DNA序列测定脱氧核糖含氮碱基磷酸AGCTDNA的基本单位－脱氧核苷酸腺嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶胸腺嘧啶DNA测序：测定未知序列确定重组DNA的方向与结构对突变进行定位和鉴定比较研究成熟的DNA测序技术始于20世纪70年代中期。●1977年Maxam和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法。●同一时期,Sanger发明了双脱氧链终止法●20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序的时代。这些技术统称为第一代DNA测序技术。第二代测序技术GSFLX测序技术（罗氏454公司）solexa测序技术（Illumina公司）SOLiD测序技术（ABI公司）三种第二代测序技术对比测序技术454SolexaSOLiD上市时间200520072007价格（万美元，2007）504559单次反应数据量0.42050读长（bp）40050*250优势长读长低测序成本，高性价比高通量，高准确度第三代测序技术第二代测序技术在制备测序文库的时候都需要经过PCR扩增，而这一PCR过程可能引入突变或者改变样品中核酸分子的比例关系。另外，第二代测序的读长普遍偏短，在进行数据拼接时会遇到麻烦。为了克服这样的缺点，业界发展出了以单分子实时测序和纳米孔为标志的第三代测序技术。Heliscope单分子测序仪SMRT技术纳米孔单分子技术Maxam-GilbertDNA化学降解法基本原理：直接或间接特异性识别4种碱基特定化学试剂可对碱基进行特异性修饰在修饰碱基处(5‘或3’)打断磷酸二酯键将一个DNA片段的5'端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而5'端被标记的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的DNA的碱基序列。操作步骤将双链DNA样品变为单链↓每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带↓分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体↓电泳,读取DNA的核苷酸顺序①先用限制性内切酶把DNA切成10—200bp的测序材料；②用碱性磷酸化酶处理该片段，消除5′末端上的磷酸；③在5′OH端标记32P，用多核苷酸磷酸激酶催化；④标记片段变性为单链；⑤用特异的化学试剂作用于不同的碱基进行修饰，然后用哌啶甲酸切断反应碱基的多核苷酸链，紧接着用四组不同的特异反应可以使末端标记的DNA分子切成不同长度的片段，产生一组其末端都是该特异碱基的长度不等的DNA片段；⑥经电泳和放射性自显影后，从4个反应系统统一阅读，待测DNA的全部核苷酸序列就可直接读出该反应的关键在于使DNA的4种核苷酸中，只有1-2种发生特异性的化学切割反应：碱基的特异性修饰；修饰的碱基从核糖环上转移；失去碱基的糖环部位发生DNA链断裂。专门用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷酸二酯键的化学试剂有硫酸二甲酯（dimethylsulphate)和肼(hydrazine)、哌啶甲酸等。肼，又称联氨NH2.NH2在碱性环境中作用于胞嘧啶C和胸腺嘧啶T的C4和C6位置导致糖苷键断裂。如果加入高浓度的盐（1.5MNaCl），肼则主要作用于胞嘧啶C使之断裂。在高温强碱作用(90℃,1.2MNaOH)下可使腺嘌呤A位点发生剧烈的断裂反应,但对胞嘧啶C的反应较弱哌啶甲酸(90℃,1mol/L)在修饰位点两端使DNA的糖-磷酸链断裂胞嘧啶胸腺嘧啶硫酸二甲酯[dimethylsulphate，DMS，（CH3O）2SO2]：一种碱性化学试剂，可以使DNA链上的腺嘌呤A的N2和鸟嘌呤G的N７甲基化，但是鸟嘌呤G的N７甲基化速度比腺嘌呤A的N2甲基化速度要快4-10倍，并且在中性pH环境中，DMS主要作用于鸟嘌呤G，使之甲基化，导致糖苷键断裂。热哌啶：使DNA链上的嘌呤在酸的作用下发生糖苷水解，导致DNA链在脱嘌呤位点（G和A）发生断裂。DNA化学降解反应体系反应体系碱基修饰试剂碱基修饰反应主链断裂试剂断裂点G硫酸二甲酯鸟嘌呤甲基化六氢吡啶GG+A甲酸脱嘌呤作用六氢吡啶G和AC+T肼嘧啶开环六氢吡啶C和TC肼（加盐）胞嘧啶开环六氢吡啶CDMS（硫酸二甲酯）在中性pH环境，主要作用于G，被六氢吡啶作用而造成该位点上DNA链的断裂。甲酸具有脱嘌呤作用。DNA链在脱嘌呤位点(G和A)发生断裂。肼，在碱性条件下，作用于T胸腺嘧啶和C胞嘧啶，在具有六氢吡啶的条件下，导致在这个核苷酸位置上发生DNA链的断裂。如果在反应体系中加入高浓度的盐，同胸腺嘧啶的反应速率便会下降，主要作用于C胞嘧啶。AC肼90C,NaOH(1.2M)断裂反应在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA的机制是：G+A反应----（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。G反应----硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，其后断开了C8-C9间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。T+C反应----肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。C反应----在NaCl存在时，只有C才能与肼发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA的机制是：G+A反应----（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。G反应----硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，其后断开了C8-C9间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。T+C反应----肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。C反应----在NaCl存在时，只有C才能与肼发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。哌啶5′—GATCACTACTG—3′标记5′—*GATCACTACTG—3′G：DMSC：肼（加盐）G+A：甲酸C+T：肼5′-*GATCACTACTG5′-*GG5′-*GATCACTACTG5′-*GATCACTA5′-*GATCA5′-*GA5′-*G5′-*GATCACTAC5′-*GATCACT5′-*GATCAC5′-*GATC5′-*GAT5′-*GATCACTACT5-*GATCACTACTG-5′-*GATCACTAC5′-*GATCAC5′-*GATC-*GATCACTACTG-在化学修饰反应过程中，通过控制反应温度和反应时间，只有一小部分碱基被修饰(而不是全部被修饰)，随后进行的断裂反应也是定量反应。因此，DNA链并不是在所有可被修饰的碱基位点断裂，而是随机断裂。在4个反应中，产生4套带相同标记末端、长短不一的寡聚核苷酸片段。只有带标记末端的片段可被识别，没有标记末端的片段可以忽略不计。、在化学修饰反应过程中，通过控制反应温度和反应时间，只有一小部分碱基被修饰(而不是全部被修饰)，随后进行的断裂反应也是定量反应。因此，DNA链并不是在所有可被修饰的碱基位点断裂，而是随机断裂。在4个反应中，产生4套带相同标记末端、长短不一的寡聚核苷酸片段。只有带标记末端的片段可被识别，没有标记末端的片段可以忽略不计。电泳和读谱具体的测定过程中，首先将3’端或5’端的双链DNA溶解在总体积为50μL的、分别含有0.03mol/LNaOH、10%甘油、1mmol/LEDTA、0.05%二甲苯蓝和0.05%溴甲酚蓝的溶液中，使双链DNA变性。然后加到由5%~10%的丙烯酰胺、0.16%~0.33%的双丙烯酰胺、50mmol/LTris-硼酸、pH8.3的1mmol/LEDTA组成的凝胶板上，进行电泳和放射性自显影等处理，制得一端带标记的单链DNA。电泳检测--310步骤１：毛细管灌胶步骤２：样品盘移动步骤３：电进样及电泳步骤４：荧光激发及检测化学法读序的方法化学法测序放射自显影图谱的识读，比较复杂一些，这是因为化学裂解反应并不完全是碱基特异性的，每组测序图谱为4或5条垂直的阶梯带，AC反应可以不做。该片从胶底部一个个向顶部读，G+A和C+T两列中含有所有相差一个碱基的DNA片段。如果G+A中出现1条带就看G列中是否有同样大小的带，若有即为G碱基，无则为A碱基；同理，C+T中则检查C列中有无同样大小条带，有即为C，无则为T。在做了AC反应时，出现较深的带时，可以帮助确定为A碱基。化学法必须4或5个反应管统一阅读，DNA中4个碱基每个位置都有1个相应的片段，待测的DNA全部序列可直接读出。化学法测序采用32P标记DNA进行，条带会较末端法更模糊，更宽，由于分辨率不足，从单块凝胶上能得到可靠序列数量约为200-300bp以内。聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开,根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列。如果G+A中出现1条带就看G列中是否有同样大小的带，若有即为G碱基，无则为A碱基；同理，C+T中则检查C列中有无同样大小条带，有即为C，无则为T。在做了AC反应时，出现较深的带时，可以帮助确定为A碱基。DNA序列测定的应用1)测序􀂋◆PCR克隆测序验证􀂋◆突变体检测􀂋◆新基因测序􀂋◆全基因组测序􀂋◆系统发育及物种鉴定􀂋2)片段分离◆个体识别：亲缘鉴定􀂋◆SNP关联分析􀂋◆疾病诊断等Maxam-Gilbert化学降解法的测序长度约250bp优点：不需要进行酶催化反应，因此不会产生由于酶催化反应而带来的误差；对未经克隆的DNA片段可以直接测序；化学降解测序法特别适用于测定含有如5-甲基腺嘌呤A或者G，C含量较高的DNA片段，以及短链的寡核苷酸片段的序列。化学降解测序法既可以标记5'-末端，也可以标记3'-末端。如果从两端分别测定同一条DNA链的核苷酸序列，相互参照测定结果，可以得到准确的DNA链序列。没有改进,操作繁琐,化学试剂的毒性大,放射性同位素标记效率偏低以致需要较长的放射自显影曝光时间,人工读取数据费时费力.目前,仅在分析特殊DNA链的核苷酸序列和分析DNA和蛋白质相互作用中的DNA一级结构时才使用缺点：