微生物分类、形态及鉴定

微生物分类、形态及鉴定主讲：林炜铁教授本章内容1、微生物概述2、微生物分类、分离及鉴定3、原核微生物形态结构4、真核微生物形态结构1、微生物概述微生物是地球上最丰富的细胞生命形式，它们在陆地和水生环境中的细胞数量超过了5×1030，比植物和动物细胞总数还多至少2-3个数量级。地球上的物种估计大约有150万，其中微生物超过10万种，而且其数目（发现）还在不断增加。什么是微生物？微生物（Microorganism）是对所有形体微小的单细胞，或细胞结构较为简单的多细胞，或没有细胞结构的低等生物的通称。微生物的类群不具细胞结构：病毒、类病毒、朊病毒原核微生物：细菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体、蓝细菌等；真核微生物：酵母菌、霉菌、担子菌、藻类等；微生物的特点个体小，比表面积大吸收多，转化快生长旺，繁殖快适应强，变异快分布广，种类多微生物与发酵工业发酵过程利用微生物作为动力，生产某种特定产物的生物化学过程。发酵产品酿造食品，酒精饮料，有机酸，核苷酸，氨基酸类物质，酶制剂，抗生素，有机溶剂其它化工产品，营养和生长必需物质，生物制药…。天然发酵[白酒、啤酒、葡萄酒、酱油…]↓纯种发酵[酒精、丙酮丁醇…]↓通风发酵[抗生素、有机酸、酶制剂…]↓代谢调控发酵[氨基酸、核苷酸…]↓基因重组菌种发酵[胰岛素、干扰素…]生物分类的两种基本原则：a）根据表型(phenetic)特征的相似程度分群归类，这种表型分类重在应用，不涉及生物进化或不以反映生物亲缘关系为目标。b）按照生物系统发育相关性水平来分群归类，其目标是探寻各种生物之间的进化关系，建立反映生物系统发育的分类系统。从进化论诞生以来，已经成生物学家普遍接受的分类原则2、微生物分类、分离及鉴定2.1.1通用分类单元分类是认识客观事物的一种基本方法。我们要认识、研究和利用各种微生物资源也必须对它们进行分类。鉴定分类命名2.1.1通用分类单元分类(classification)：根据一定的原则对微生物进行分群归类，根据相似性或相关性水平排列成系统，并对各个分类群的特征进行描述，以便查考和对未被分类的微生物进行鉴定；命名(nomenclature)：是根据命名法规，给每一个分类群一个专有的名称；鉴定(identification）：借助于现有的微生物分类系统，通过特征测定，确定未知的、或新发现的、或未明确分类地位的微生物所应归属分类群的过程。分类单元及其等级界（Kingdom）门（Phylum）纲（Class）目（Order）科（Family）属（Genus）种（Species）根据CarlWoese的理论，现在还在界之上使用域(domain)域（Domain）把全部生物先分为古生菌域、细菌域和真核生物域；只有真核生物域下再分为原生生物界、真菌界、动物界和植物界。细菌域古菌域常用的细菌分类学术语1）培养物(culture)：一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长物。如微生物的斜面培养物、摇瓶培养物等。2）菌株(strain)：从自然界中分离得到的任何一种微生物的纯培养物都可以称为微生物的一个菌株；用实验方法(如通过诱变)所获得的某一菌株的变异型，也可以称为一个新的菌株，以便与原来的菌株相区别。BacillussubtilisASI.398BacillussubtilisBF7658生产蛋白酶生产α淀粉酶常用的细菌分类学术语3）种（species）：物种，生物分类中基本的分类单元。具有高度特征相似性的菌株群，这个菌株群与其他类群的菌株有很明显的区别。原核生物的种是根据表型和基因型的不同而定义。更精确的定义：一各种（基因型种）是有相似G+C組成和有70%或以上之DNA杂交实验判定之集合由于基因序列的数据增加，种或许可以定义为具有相同序列种可能是生物其主要管家基因housekeepinggene(所有细菌细胞都需要的基因)具有相同序列的集合。每一个种都属于一個属(genus)。2.1.2微生物命名国际细菌命名法规：1.细菌名称发表的优先权为1980年1月1日。2.新种的命名不应与已发表的真菌，藻类、原生动物同名。3.种名要用拉丁文,用双名法表示，新种要有典型菌株，新属要有典型种，并要同时发表菌种的保藏号。4.新种(属)要在“国际系统分类细菌学杂志”(IJSB)上发表。5.菌名的更改要得到仲裁委员会同意，并发表在IJSB上才能有效。双名法规定:一个生物的种名,由“属名+种名”构成，用斜体表示。原核微生物的学名，除了“属名+种名”外，还要在学名后面用正体写出最先定名的人名和时间(年代)。如果发现了一个原核生物，通过初步研究只知属于哪一个属，不知是何种时可用下列方式表示：属名+sp.(单数)或spp(复数)。“双名法”种名：用来描述颜色、形状、来源或科学家的名字。种名第一个字母小写。如：Escherichiacoli属名：用来描述主要特征、构造或者科学家的名字。属名第一个字母要大写。2.1.3微生物在自然界的地位五界系统真菌植物动物原生生物原核生物(Whittaker，1969)在前人分类研究的基础上提出了生物的五界系统。古生菌真核生物真细菌三原界系统基于rRNA核苷酸序列的同源性Eubacteria（真细菌界）Archaebacteria（古细菌界）Eukarya（真核生物界）CarlWoese利用rRNA建立分子进化树微生物（病毒）古生菌（Archaea）细菌（Bacteria）:真菌（酵母、霉菌、蕈菌等）、单细胞藻类、原生动物等.非细胞型细胞型原核微生物真核微生物古生菌在进化谱系上与真细菌及真核生物相互并列，且与后者关系更近，而其细胞构造却与真细菌较为接近，同属于原核生物。rRNA系统发育分析对微生物分类的贡献a）使生物进化的研究范围真正覆盖所有生物类群；b）提出了一种全新的正确衡量生物间系统发育关系的方法；c）对探索生命起源及原始生命的发育进程提供了线索和理论依据；d）突破了细菌分类仅靠形态学和生理生化特性的限制，建立了全新的分类理论；e）为微生物生物多样性和微生物生态学研究建立了全新的研究理论和研究方法，特别是不经培养直接对生态环境中的微生物进行研究。2.2微生物的分离•无菌技术•固体培养基分离•液体培养基分离•单细胞（单孢子）分离•选择培养分离2.1.1无菌技术无菌技术：在分离、转接及培养纯培养(物)时防止其被其他微生物污染的技术。成功分离和培养微生物的关键。消毒：灭菌：指杀死病原微生物、但不一定能杀死细菌芽孢的方法。指用物理或化学的方法杀灭全部微生物，包括致病和非致病微生物以及芽孢，使之达到无菌保障水平。主要的消毒和灭菌方法1）灼烧灭菌主要的消毒和灭菌方法2）干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。3）湿热灭菌：100kPa、121/115℃下维持15-30min。主要的消毒和灭菌方法4）紫外消毒5）消毒剂消毒：75%乙醇、75%异丙醇，50%戊二醛（陶氏）等。6）气体消毒：甲醛、环氧乙烷、石碳酸（苯酚）等。2.2.2固体培养基分离菌落：单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。菌苔：当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。固体培养平板稀释倒平板法：•无菌水、梯度稀释、50℃左右的琼脂培养基、灭过菌的培养皿。注意要稀释得当。•分离出单个菌落以后，重复上述操作数次，便可得到纯培养。涂布平板法&稀释倒平板法平板划线分离法2.2.3液体培养基分离用于细胞大的细菌、原生动物和藻类等的纯化分离。稀释法：经高度稀释后，同一个稀释度的试管中大多数（95%以上）表现不生长，很可能得到的是纯培养。2.2.4单细胞（单孢子）分离单细胞分离：采取显微分离技术从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比。个体较大的可在低倍显微镜下进行，个体较小的则需采用显微操作仪。2.2.5选择培养分离高温抗生素筛选选择性富集作用高温菌抗生素抗性菌特异性底物代谢菌2.3微生物的鉴定形态学特征生理学特征生态学特征从不同层次，用不同学科的技术方法来研究和比较不同微生物的细胞、细胞组分或代谢产物，从中发现的反映微生物类群特征的资料。分子生物学水平2.3.1微生物鉴定的传统指标2.3.2分子生物学指标指标•G-C含量•rDNA分析•核酸分子杂交•脉冲场电泳分型•基因指纹图谱•全基因组测序G-C含量分类学上，用G+C占全部碱基的克分子百分数(G+Cmol%)来表示各类生物的DNA碱基因组成特征。每个生物种都有特定的GC%范围，因此可以作为分类鉴定的指标。细菌的GC%范围为25--75%，变化范围最大，因此更适合于细菌的分类鉴定。G-C含量同一个种内的不同菌株G+C含量差别应在4～5%以下；同属不同种的差别应低于10～15%；G+C含量已经作为建立新的微生物分类单元的一项基本特征，它对于种、属甚至科的分类鉴定有重要意义。若二个在形态及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其G+C含量的差别大于5%，则肯定不是同一个种，大于15%则肯定不是同一个属。但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它们之间具有近的亲缘关系。rDNA细菌真菌核酸杂交1）DNA-DNA杂交：亲缘关系相对近的微生物之间的亲缘关系比较Southernblot脉冲场电泳分型（pulsedfieldgelelectrophoresis,PFGE）基因指纹图谱技术基因指纹图谱技术扩增rDNA限制性片段分析（ARDRA）限制性酶切片段长度多态性分析（RFLP）单链构象多态性分析（SSCP）末端限制性片段长度多态性分析（T-RFLP）变性梯度凝胶电泳（DGGE）温度梯度凝胶电泳（TGGE）扩增片断长度多态性（AFLP)随机扩增多态性DNA（RAPD)全基因组测序3、原核微生物形态结构3.1细菌（Bacteria）3.2放线菌(Actinomycetes）3.3蓝细菌(Cyanobacteria)3.1细菌（Bacteria）3.1.1一般形态及细胞结构个体形态和排列球状杆状螺旋状基本形态球菌（coccus）菌体呈球形或近似球形,以典型的二分裂殖方式繁殖,分裂后产生的新细胞常保持一定的空间排列方式.根据细胞分裂的方向及分裂后的各子细胞的空间排列状态不同,可将球菌分为以下几种:单球菌、双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌等。(1)单球菌分裂后的细胞分散而单独存在的球菌.如尿素微球菌(Micrococcusureae)(2)双球菌分裂后两个球菌成对排列的为双球菌.如肺炎双球菌(Diplococcuspneumoniae)(3)链球菌分裂是沿一个平面进行，分裂后细胞排列成链状.如乳链球菌（Streptococcuslactis）(4)四联球菌分裂是沿两个相垂直的平面进行，分裂，分裂后每四个细胞在一起呈田字形.如四联微球菌（Micrococcustetragenus）(5)八叠球菌按三个互相垂直的平面进行分裂后，每八个球菌在一起成立方体形。如藤黄八叠球菌（Sarcinaureae)(6)葡萄球菌分裂面不规则，多个球菌聚在一起，像一串串葡萄。如金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)杆菌（bacillus）杆菌是细菌中种类最多的类型，因菌种不同，菌体细胞的长短、粗细等都有所差异。杆菌的形态：短杆状、长杆状、棒杆状、梭状、梭杆状、月亮状、分枝状、竹节状等；按杆菌细胞的排列方式则有链状、栅状、“八”字状以及有鞘衣的丝状等。短杆菌长杆菌梭状芽孢杆菌单杆菌双杆菌链杆菌球杆菌大肠杆菌双歧杆菌螺菌（vibrio/spirillum/spirochete）螺旋状的细菌称为螺旋菌，根据其弯曲情况分为：弧菌：螺旋不满一圈，菌体呈弧形或逗号形例：霍乱弧菌、逗号弧菌螺旋菌：螺旋满2—6环，螺旋状例：干酪螺菌螺旋体：旋转周数在6环以上，菌体柔软。例：梅毒密螺旋体弧菌螺旋菌螺旋体菌霍乱弧菌幽门螺旋菌特殊形态柄细菌、肾形菌、臂微菌、网格硫细菌、贝日阿托氏菌(丝状)、具有子实体的粘细菌等是特殊形态的细菌。影响细菌形态的因素：培养时间、培养温度、培养基成