单克隆抗体&疾病诊断

单克隆抗体•中文名称：–单克隆抗体•英文名称：–monoclonalantibody;McAb;mAb•定义1：–高度均质性的特异性抗体，由一个识别单一抗原表位的B细胞克隆所分泌。一般来自杂交瘤细胞。•应用学科：–免疫学（一级学科）；免疫系统（二级学科）；免疫分子（三级学科）•定义2：–只识别一种表位(抗原决定簇)的抗体，来自单个Ｂ淋巴细胞的克隆或一个杂交瘤细胞的克隆。•应用学科：–生物化学与分子生物学（一级学科）；总论（二级学科）•定义3：–由单一杂交瘤细胞克隆分泌的只能识别一种表位（抗原决定簇）的高纯度抗体。•应用学科：–细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科）What单克隆抗体•动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。How制备单克隆抗体1）免疫脾细胞的制备2）骨髓瘤细胞的培养与筛选3）细胞融合的关键:1技术上的误差常常导致融合的失败。2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。4）阳性克隆的筛选应尽早进行。5）克隆化6）细胞的冻存与复苏7）大规模单克隆抗体的制备选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。单克隆抗体的提纯＆保存•一般常用金黄色葡萄球菌蛋白A－琼脂糖4B亲和层析法。•单克隆抗体的保存由腹水中获得的抗体,经离心去除细胞成分，再经冷冻超速离心,取上清液加0.1％NaN3，少量分装，冷冻于-70℃可保存几年。但应避免反复冻融,否则抗体失活，特别是IgM抗体。提纯的单克隆抗体,冷冻干燥保存于2～8℃，取出时溶解后，保存于2～8℃，至少一个月内可保持稳定。腹水抗体也可冷冻干燥低温(4℃)保存两年，融化后放置4℃下保存一个月。短期使用的腹水抗体，4℃3～4个月仍保持稳定,培养上清加0.1％NaN3，贮于-20℃，两年不失活性。杂交瘤技术单克隆抗体的制备单克隆抗体的应用•检验医学诊断试剂•蛋白质的提纯•小分子抗体的应用•抗体融合蛋白的应用•双特异抗体的应用检验医学诊断试剂•病原微生物抗原、抗体的检测•肿瘤抗原的检测•免疫细胞及其亚群的的检测•激素测定•细胞因子的测定病原体测定：肝炎病毒－HAV,HBV,HCV,HDV,HEVTORCH－弓形虫,风疹病毒,巨细胞病毒，单纯疱疹病毒细胞表面CD测定：CD4/CD8:Th/Tc白血病的分型激素的测定：内分泌疾病的诊断药物测定(TDM)：抗排斥药物抗肿瘤药物地高辛免疫沉淀MACS二、蛋白质的提纯单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质（如Speharose2B、4B、6B等）上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或pH，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。三、小分子抗体的应用定义：分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段优点：分子量小,穿透性强,抗原性低不含Fc段，不会与带有Fc段受体的细胞结合，不良反应少可在原核系统表达及易于基因工程操作半衰期短，有利于及时中和及清除毒素应用：用于肿瘤的导向治疗肿瘤的影像分布基因治疗细胞内抗体：在细胞内表达特异性识别某一基因产物可干扰该基因产物的生物活性研究基因结构与功能的关系四、抗体融合蛋白的应用肿瘤的体内显像诊断单链抗体排除速度快，穿透力强，在肿瘤组织中的分布指数较完整抗体分子高放射显像时，放射性核素排除较快，对身体危害程度小，显像的本底较低理想的显像定位诊断载体病毒的诊断和抗病毒感染血液性疾病的诊断白血病的免疫诊断及分型五、双特异抗体的应用在体外免疫检测中的应用自身红细胞凝集试验快速检测HBV和HIV病原体等避免化学交联减低两者的活性，从而提高酶免疫检测的敏感度用双特异抗体作为二抗，检测限达1ng/ml在体内肿瘤放射免疫显像诊断中的应用方法：双特异抗体的一只臂结合靶抗原，一只臂结合半抗原螯合剂，后者可选择性地与放射性核素结合，利用二次导向系统显示特点：更高的的灵敏度和清晰度在体内免疫治疗中的应用抗体分子可与放射性核素、细胞毒药物、毒素、等多种分子相融合，这些分子在抗体结合靶分子后可提供重要辅助功能双功能抗体可有效针对低水平的肿瘤相关抗原，并将细胞毒物质输送到肿瘤细胞抗体还可与携带药物的脂质体、各种PEG偶联，从而增强体内运输和药代动力学成就•国外：•自1975年建立B淋巴细胞杂交瘤制备McAb成功以来，到现在的近30年间，又做了大量的工作，并取得了明显的进展。美、英、日、法等国于1978年起先后建立了McAb公司100多家，并于1979年将第一个杂交瘤产品供应市场，现已有几十种杂交瘤细胞株和几百种McAb商品化，投入市场。现在全世界已有1000多个实验室从事这方面的研究工作，并形成一股McAb“生产热”，估计全世界研究建立的杂交瘤细胞株数已达5万种以上。为交流总结McAb的研究工作经验，在法国Bussard教授的倡议下，组成了“国际杂交瘤细胞专家委员会”，附属在国际免疫学会中；还建立了一个“国际杂交瘤细胞及其产物McAb资料数据库”，专门搜集有关杂交瘤细胞的信息，并回答各种咨询。•1.至今，国内外报道的动物用单抗已达数百种，据不完全统计，其中针对畜禽病原体的有163种，几乎包括了国内外严重流行的大多数传染病和寄生虫病。另有36种分别针对14种动物(包括人)的免疫球蛋白单抗，另外57种分别是针对动物激素、独特型和动物组织抗原等的单抗。这些单抗试剂主要用于下列几个方面：①用于生物医学各学科的基础研究；②用于疾病的诊断、检疫及流行病学研究；③用于疾病预防与治疗；④用于生物活性物质的提取；⑤用于妊娠诊断，性别鉴定和鉴别控制，促我国动物用单抗的研究发展亦很快，取得了多项研究成果，有的已在较大范围推广应用，获得了显著的经济效益和社会效益，如马传染性贫血单抗诊断试剂盒和旋毛虫单抗快速ELISA诊断试剂盒，另有10多种单抗试剂盒已完成或即将完成开发研究。动物用单克隆抗体的发展前景•First.动物用McAb必须走向产业化今后动物用单抗的研究重点应放在产业化上，将现有成果转化为生产力。目前，我国动物用单抗的成果大多数还没有产业化，其实现产业化的进程总体上很缓慢。为此，要加速这一进程，下列几点必须引起重视。要突破“单抗建株、鉴定”的研究框架，从研究工作开始，就应着眼其应用价值，这一问题主管部门和研究人员都要重视。在很多方面，单抗的应用要解决的技术问题更多更复杂，其所需的人力、物力、财力的投入亦较大。要选准产业化的目标，以点带面，上述数百种单抗其开发应用价值不尽一致，作为动物用单抗开发的产品，应具备一定的条件，以针对畜禽疾病单抗试剂为例，应包括单抗针对的疾病流行范围广、发病率高、经济意义大，或有重要的公共卫生意义；单抗能解决常规诊断试剂无法解决的问题，如在临床上区分强毒感染和疫苗毒感染所引起的免疫应答；单抗的适用性要大等，目前，口蹄疫、猪瘟、新城疫、伪狂犬病、鸡传染性法氏囊病、沙门氏菌病、布鲁氏菌病、钩端螺旋体病、弓形虫病、大肠杆菌病、畜禽Ig单抗等诊断盒应在短期内完成产业化进程。建立产品基地，区域试验基地，促进单抗试剂的产业化。理顺单抗试•Second.动物用McAb的应用领域要拓宽分析上述动物用单抗的类别，不难看出动物用单抗研究存在很大的不平衡，有许多空白尚需填补，如有一些主要传染病(包括人兽共患病)的病原体单抗还未研制；对于寄生虫病病原单抗、真菌毒素单抗，以及水产业的动物病原体单抗和生物毒素单抗、畜禽繁殖育种用单抗等国内外的研究仍处于起步阶段，应予加强；对于畜牧兽医科学中其他学科亦应多加引入单抗技术的应用研究，这样将更加广泛深入地促进相关学科的发展。另一方面，动物用单抗的基础研究方面应有重点的解决一些关键问题。以动物传染病为例，单抗与分子生物学的有机结合将越来越深入地揭示动物传染病病原体的分子病理发生机制、抗原结构，以及特定的致病基因等。而单抗在基因工程中的应用，加快了基因工程疫苗的研究进程。此外，3.研制新型抗体新型抗体是利用生物技术改建和生产的抗体，包括嵌合抗体、重构抗体、单链抗体、单域抗体、抗独特型抗体及酶抗体等。新型抗体的研究不仅具有重要的理论价值，而且在疾病的预防和诊疗上的意义也日趋明显。新型抗体的研究与生产将克服常规单抗技术的繁琐过程，不仅扩大了抗体的应用功能，而且为产业化生产带来了便利。因此，应积极开展动物用新型抗体的研究。