单克隆抗体的制备和应用

第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备第一节杂交瘤技术的基本原理第一代抗体多克隆抗体（polyclonalantibody)第二代抗体单克隆抗体（monoclonalantibody)第三代抗体基因工程抗体（geneticengineeringantibody)抗体种类。淋巴细胞。淋巴细胞发育。浆细胞。抗原接种BALB/c小鼠7~12周龄20~25g体重动物B淋巴细胞:寿命短,分泌特异系性抗体骨髓瘤细胞：寿命长杂交瘤细胞：寿命长，单克隆抗体单克隆抗体聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤细胞系单克隆抗体生成：接种杂交瘤细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体杂交瘤技术原理流程RPM1640培养液DMEM培养液培养液PEG:分子量4000的PEG是最常用的细胞融合剂作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同细胞融合剂次黄嘌呤磷酸核糖转化酶胸腺嘧啶核苷激酶HGPRT酶与TK酶H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNAHAT培养基8-杂氮鸟嘌呤聚乙二醇应用液不产生Ig的重链和轻链HGPRT-;TK-与提供淋巴细胞的动物品系相同骨髓瘤细胞系的选择SP2/O:HGPRT-，TK-;长命淋巴细胞:HGPRT+，TK+;短命(7天)杂交瘤细胞:HGPRT+，TK+;长命骨髓瘤细胞、淋巴细胞与杂交瘤细胞淋巴细胞：不能生长，5-7天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断骨髓瘤细胞：不能生长，5-7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻HAT选择作用长期生长繁殖。利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA，从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力杂交瘤细胞有限稀释法显微操作法FACS法半固体琼脂糖法克隆化特点：不需任何特殊设备克隆出现效率高实验室常用方法方法：细胞悬液通过系列稀释每个培养孔含0.5～1个细胞有限稀释法效率最高价格昂贵FACS配制方案：杂交瘤细胞（1～5x106/ml)+细胞冻存液(30%-40%牛血清，50%-60%RPMI-1640培养液，10%DMSO)“慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮“快融”：取出立即浸入37℃-40℃水浴中，使其迅速融化、复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏防止污染避免染色体丢失防止非分泌细胞的过度生长防止细胞密度过高而死亡细胞冷冻的意义第二节单克隆抗体制备选择对数生长期的细胞进行传代培养细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于-80℃或液氮及干冰中培养骨髓瘤细胞1×108淋巴细胞无菌手术免疫脾细胞的制备细胞密度过低不利于细胞生长繁殖常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞其中MQ还有清除死亡细胞的作用饲养存活一般不超过2周，不影响杂交瘤细胞的纯化采取饲养细胞。饲养细胞骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3)50%PEG1min内加完;2min内加10ml培养液融合方法SP2/0细胞与脾细胞的比例为1：2-51ml50%的PEG（无菌，预温37℃）在1分钟内滴完,静置90秒,时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止PEG作用根据细胞数量加入HAT培养基，使之分加到96孔板中时每孔细胞数为0.5-1.5×105个。融合后7天，换用HT培养液。细胞融合10~20天出现克隆HAT筛选挑克隆融合细胞的早期培养可溶性抗原：ELISA抗体捕获法细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法（用丙酮和甲醇按1:1比例固定细胞）筛选常用方法ELISAELISA多头加样枪。免疫荧光法体外培养中空纤维培养系统单抗含量不高，牛血清Ab难以去除动物接种每次用BALB/c或F1代小鼠，5-10╳105/只生产单克隆抗体细胞性抗原：1-2×107/只，不加佐剂，2-3周重复一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3-6周100-200微克抗原，融合前3天，加强免疫免疫小鼠腹腔注射法前5天进行,预先腹腔注射pristane1~5×106细胞1~3w形成腹水高滴度腹水盐析沉淀亲和层析离子交换层析McAb的纯化Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法特异性测定：抗原类似物的交叉反应效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞争抑制法，相加指数法及微机集群分析亲和性测定：测定亲和常数K杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条McAb靶抗原分子量：常用westernblotMcAb的鉴定McAbPcAb抗原要求可以不纯纯度高得量高低特异性高低稳定低高沉淀反应无有成本高低McAb与PcAb的比较McAbandPcAb第三节基因工程抗体根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。基因工程抗体Geneticengineeringantibody将小鼠的CDR序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称为CDR移植抗体将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体人源化抗体方法：从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力嵌合抗体chimericantibody嵌合抗体chimericantibody人抗体V区的骨架区取代鼠源单抗CDR以外骨架区改型抗体reshapedantibody定义：指利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补决定簇（CDR）序列改换成鼠源单抗CDR序列。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。RAb亦叫“重构型抗体”，因其主要涉及CDR的“移植”，又可称为“CDR移植抗体意义：多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗改形抗体（RAb）Fab：抗原结合片断Fv：可变区片段ScFv：单链可变区片段小分子抗体小分子抗体其它生物活性蛋白融合抗体融合蛋白许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。双特异性抗体化学交联BsAb分别分离纯化两种不同的McAb，使各抗体解离为单价抗体，再使两种不同抗原特异性的单价抗体通过化学试剂交联起来，然后分离出目的组分。此法缺点是容易导致抗体失去活性，产物均一性不佳。基因工程BsAb多采用抗体分子片段,如Fab,Fv或ScFv,经基因操作修饰后,或体外组装为BsAb,或直接表达分泌型的BsAb。双特异性抗体细胞工程BsAb将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再次融合，产生四源杂交瘤(quadroma)。但二次杂交瘤细胞株分泌的是两套重链，轻链的随机组合物。BsAb在其中的比例可为10%～50%不等。多倍杂交瘤细胞的稳定性差，BsAb的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免疫反应(HAMA)，因此不适用于临床。双特异性抗体定义：将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体，在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性噬菌体抗体库技术用PCR扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。抗体库：组合抗体文库：在建库过程中如果将VH和VL随机组合人天然抗体库：抗体mRNA来源于未经免疫的正常人基本原理噬菌体抗体库①从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B淋巴细胞，提取mRNA并逆转录为cDNA；②应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的Ig基因片段；③构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体有λ噬菌体、丝状噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体抗体库(surfacedisplayantibodylibrary)常用载体；④表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲合吸附-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。构建噬菌体抗体库模拟天然全套抗体库抗体文库可以达到或超过1011库容,能包含B细胞全部克隆建库的外源基因来自人体多克隆细胞的总mRNA通用引物具有人的种属普遍性抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性噬菌体抗体库特点避开了人工免疫和杂交瘤技术抗体库的大容量抗体库极高的筛选效率可获得高亲和力的人源化抗体VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程所用的抗体基因又来自人体第四节单克隆抗体应用诊断病原体肿瘤的诊断淋巴细胞表面标志物检测检验医学体外诊断试剂标记免疫测定肝炎病毒:HAV,HBV,HCV,HDV,HEVTORCH：弓形虫,风疹病毒,巨细胞病毒，单纯疱疹病毒病原体测定CD4/CD8:Th/Tc白血病的分型细胞表面CD测定内分泌疾病的诊断激素的测定药物测定(TDM)抗排斥药物抗肿瘤药物地高辛越来越多未知功能cDNA的克隆对复杂的基因功能和多肽蛋白功能的研究需求增加研究工作中的探针免疫沉淀干扰素的精制物质的纯化MACS同位素标记McAb进行影像诊断体内定位诊断定义：分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段优点：分子量小,穿透性强,抗原性低不含Fc段，不会与带有Fc段受体的细胞结合，不良反应少可在原核系统表达及易于基因工程操作半衰期短，有利于及时中和及清除毒素小分子抗体用于肿瘤的导向治疗肿瘤的影像分布基因治疗细胞内抗体：在细胞内表达特异性识别某一基因产物可干扰该基因产物的生物活性研究基因结构与功能的关系肿瘤的体内显像诊断单链抗体排除速度快，穿透力强，在肿瘤组织中的分布指数较完整抗体分子高放射显像时，放射性核素排除较快，对身体危害程度小，显像的本底较低理想的显像定位诊断载体病毒的诊断和抗病毒感染血液性疾病的诊断白血病的免疫诊断及分型抗体融合蛋白抗体分子可与放射性核素、细胞毒药物、毒素、等多种分子相融合，这些分子在抗体结合靶分子后可提供重要辅助功能双功能抗体可有效针对低水平的肿瘤相关抗原，并将细胞毒物质输送到肿瘤细胞抗体还可与携带药物的脂质体、各种PEG偶联，从而增强体内运输和药代动力学体内免疫治疗应用自身红细胞凝集试验快速检测HBV和HIV病原体等避免化学交联减低两者的活性，从而提高酶免疫检测的敏感度用双特异抗体作为二抗，检测限达1ng／ml双特异抗体应用体外诊断方法：双特异抗体的一只臂结合靶抗原，一只臂结合半抗原螯合剂，后者可选择性地与放射性核素结合，利用二次导向系统显示特点：更高的的灵敏度和清晰度体内肿瘤放射免疫显像