4只健康的成年犬发生致命犬疱疹病毒1型呼吸系统感染

4只健康的成年犬发生致命犬疱疹病毒1型呼吸系统感染姓名：蔡利东班级：18级兽医专硕摘要四只健康成年犬（两只金毛巡回猎犬6岁和9岁，大麦町犬13岁，马士提夫獒犬5岁）发生了严重的的呼吸道症状，在出现临床症状后2-7内死亡。3只送检犬（除了马士提夫獒犬）的肺脏呈现严重弥漫性的发红，由出血和充血所导致。显微镜镜检提示急性病毒性或中毒性呼吸道损伤，程度从急性纤维素性支气管坏死或出血性支气管肺炎到纤维素性或坏死性支气管间质性肺炎不等。死去的犬还有出血性的鼻炎和坏死性支气管炎。采用病毒分离、透射电镜和聚合酶链反应（PCR）等方法，证实犬肺标本中存在犬疱疹病毒1型(CaHV-1)。A型流感病毒、犬瘟热病毒、副流感病毒、犬呼吸冠状病毒、犬腺病毒2型均为阴性。犬疱疹病毒1型已经从狗的急性呼吸道感染病例中分离出来，但很少与成年犬致命性的原发病毒性肺炎联系在一起。本报告中发现了与CaHV-1有关的4例成年犬致命性疱疹病毒肺炎的病灶。疱疹病毒1型•疱疹病毒1型（CAHV-1）属于水痘病毒属，疱疹病毒亚科，DNA病毒，有囊膜，最适温度35-37℃，具有宿主特异性，仅感染犬科动物（1-6周龄的幼犬），死亡率接近100%，也可以感染成年犬，临床症状比较轻微。只可以在犬细胞中培养，其特异性主要是由于宿主细胞上存在功能不明的特异性受体。对温度，乙醚，酸性条件均比较敏感，在56℃条件下处理4分钟，PH4.7条件下处理30分钟，病毒失去活性。用普通的消毒剂如新洁尔灭就可杀死环境中的疱疹病毒。CAHV-1是一种自然界普遍存在的病毒，在全世界均有流行。分娩过程通过产道传播，也可以在子宫中通过胎盘传播直接接触染病动物的的口鼻分泌物感染动物分泌物污染的器具（较少）传播途径通过交配传播（成年的犬科动物）临床症状•幼犬（≤2周）：可在分娩过程中或分娩后迅速感染，潜伏期6-10天，主要表现为持续的哀嚎，精神沉郁，食欲减退，严重时厌食，甚至食欲费绝，体重降低，粪便稀软，色泽较黄，直肠温度下降；触诊腹部时，腹部紧张，有疼痛表现，眼部有大量黏脓性的分泌物，黏膜上有广泛的出血点，有的犬表现鼻炎症状，有浆液性鼻漏，鼻粘膜表面有广泛性斑点状出血，股内侧皮肤可变成红色丘疹。病犬后期角弓反张、癫痫、知觉丧失。康复的犬可造成永久性神经症状，运动失调、失明等后遗症。当出现明显的临床症状，常在24-48小时内死亡。•幼犬（≥3周）：主要引起呼吸道的炎症，出现不同程度的气管炎和支气管炎，咳嗽，打喷嚏，严重时发展为全身系统性的感染。当发生继发感染时，可以引起肺炎症状。死亡率较低，大部分可以痊愈。•成犬（≥1岁）：当病犬康复后，CAHV-1可以潜伏在三叉神经、腰骶神经和前庭神经节的神经元中，可以被再次激活，导致成年犬科动物出现轻微的呼吸道炎症，咳嗽，打喷嚏，通常在感染4-5天内，眼部常出现一过性结膜炎症状。母犬以生殖道感染为主，阴道粘膜弥漫性小泡状病变，可造成妊娠母犬弱仔，流产，死胎及不孕，分娩的弱仔大多在分娩后的几天死亡。公犬可见阴茎和包皮慢性炎症，包皮内可有大量脓性分泌物。病理解剖学改变解剖可见不同程度的组织损伤，气管和支气管淋巴结肿胀出血，上呼吸道有卡他性炎症，严重时鼻腔有明显的广泛性的出血，支气管出现出血坏死。肝脏、肾脏、肾上腺、小肠等脏器上有出血点，并散在针尖至栗粒大的灰白色坏死灶。尤其是肾脏、肺脏变化明显。肾脏肾皮质呈弥漫性淤血性出血,包膜下则有鲜红出血点，肾脏断面的皮质与髓质交界处形成出血灶，这是本病的特征性肉眼变化。血性支气管肺炎，纤维素性或坏死性支气管间质性肺炎。脏脾肿大，胸腔、腹腔内有带血的浆液性液体积留。肠系膜点状出血、肠系膜淋巴结肿大,呈出血状。部分犬呈现明显的胃肠道出血病理组织学改变•理组织学改变:肾境界层的毛细血管扩张,充满血液,肾小管之间有大量红细胞浸润,肾小管发生坏死、崩解、坏死灶周围有嗜酸性核内包涵体。大脑呈坏死性脑炎变化,见脑膜和脑实质内的小血管充血,血管周围淋巴间隙扩张,并有不同数量的淋巴细胞、浆细胞环形集聚,神经细胞固缩、变性乃呈坏死,周围有神经胶质细胞凝集、围绕,还可见变性、坏死的胶质细胞和崩解的纤维组成的脑内坏死灶。其它肝、脾脏器的病变呈现典型的坏死性血管炎病变。有些病理也会出现脑部的病变，水肿出血。实验背景•CAHV-1是犬的一种高度传染性和致死性的疾病，对犬的繁殖造成严重的经济损失,1965年Carmichael和Stewart氏分别在美国和英国首次分离到犬疱疹病毒以后,才引起人们的注意,并相继在世界不同地区分离出病毒。主要是引起2周龄内的幼犬先发生严重的呼吸道症状，全身多系统的病变，出现典型症状后2天死亡，致死率可达100%。成年犬一般仅有轻微的呼吸道症状，但最近陆续有一些报道该病毒也会导致成年犬的致死性呼吸道病变，病程较短，死亡率很高。长期以来，对于该病的研究以及宣传普及仍处于较低的水平，没有系统的诊断治疗措施，现阶段只有依靠电子显微镜以及PCR技术检测；目前疫苗研制进展不大，现没有疫苗可用。实验目的•CAHV-1主要感染幼年的犬科动物，引起严重的呼吸道症状，甚至导致死亡；但是其很少引起成年犬科动物的致死性症状，在世界范围内仅有几起相关的报道。这几起报道中，大部分的病犬都处于免疫抑制或低下的条件下，例如癌症，化疗，放射治疗，长时间使用皮质醇激素，或手术后。•这次发现的四只病犬，均为成年犬，其中一只老年犬（斑点犬平均年龄12-15岁）健康程度较高，其它三只犬身体状况也较良好，没有使用抑制免疫的相关药物，在出现明显的呼吸道症状后迅速死亡，经检测后确诊为CAHV-1感染；其它呼吸性致死病毒，例如，犬瘟病毒，流感病毒，副流感病毒，呼吸性冠状病毒均为阴性。为了验证诊断结果的正确性，研究CAHV-1病毒的致病机制，为以后防治提供理论依据，为保障动物健康，促进宠物行业的发展贡献力量。实验方法1.采集病料：在征求主人同意的前提下，采集病理组织（心脏，脑，气管，食管，肺脏，鼻甲骨，肾脏，肝脏，脾脏，尿道，胃，大小肠，气管、支气管淋巴结，还有甲状腺、肾上腺、垂体和骨髓）放在福尔马林缓冲液保存，石蜡包埋，切片（4微米），苏木紫伊红染色，光学显微镜观察。其中肺脏组织的代表性样本单独在-80℃下保存，新鲜肺脏组织用黄色固定剂（2%戊二醛，2%多聚甲醛，0.2%苦氨酸，0.1Mcacodylate-HCl缓冲液）固定便于透射电镜的观察。2.病毒分离：肾脏细胞在含有10%胎牛血清的培养基里培养。肺脏细胞用冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）平衡，离心，滤过（0.22-mMfilters），接种到MDCK细胞，37℃，5%CO2培养3天。从MDCK细胞中提取DNA，进行PCR检测（引物以及其他试剂实现准备好），对提取的DNA测序,结果与NCBI上查到的CAHV-1基因序列进行比较。3.透射电镜观察：对接种的MDCK细胞，黄色固定剂固定的新鲜肺脏组织，福尔马林保存的肺脏组织进行透射电镜观察。试验结果组织解剖学观察：3只死狗的身体状况都很好。90%以上的肺都有暗红色到紫色的粗大斑纹，肿胀，潮湿，有轻微的橡胶质地，质地从柔软、微弹性到吱吱作响不等。气管弥漫性变红，管腔内充满泡沫。鼻甲骨有红变黑，呈弥漫性的分布。气管和支气管含有适量的红染、泡沫状液体，类似液体从切面渗出。胸腔含有150毫升的红色半透明液体。由于心内膜异位、左房扩张、左房心内膜纤维化和局部腱索断裂，心脏边缘有严重的光滑结节状瓣膜增厚。组织病理学：鼻甲骨的呼吸上皮发生溃疡，固有层被一层厚厚的纤维蛋白、坏死的细胞碎片和出血覆盖，填补了鼻甲骨之间的空隙。由于水肿、纤维蛋白渗出、出血和坏死细胞碎片，整个固有鼻甲骨椎板明显扩张。•固有鼻甲骨椎板中中度炎症浸润包括大量巨噬细胞和少量中性粒细胞、淋巴细胞和浆细胞。只有少数鼻腺体残留，其中许多含有坏死、腔内、细胞碎片。气管黏膜溃疡，固有层被少量巨噬细胞混合的纤维蛋白覆盖。气管固有层有少量淋巴细胞及浆细胞。支气管和细支气管几乎完全丧失了上皮细胞，固有层被纤维蛋白膜覆盖。大部分上皮细胞脱落进入气道腔。支气管和细支气管水肿，含有纤维蛋白，偶尔伴有少量中性粒细胞和细胞碎片。大量的纤维蛋白和明显充血引起的水肿使支气管壁明显扩张。纤维蛋白和水肿从更大的气道延伸并充满肺泡。肺内的表现与大体检查所见的全身斑驳的红色外观一致，是典型的支气管间质性肺炎，多灶性的实变，肺泡中含有大量的泡沫以及巨噬细胞，中度出血。肝脏表面有多灶性的病变，广泛播散了小叶中心凝固性坏死和充血的病灶。淋巴结有程度不等的淋巴细胞耗尽，个别细胞分散坏死。•微生物学和分子诊断试验：3例患者的肺培养均无细菌生长。采用标准化的分子诊断方法（包括PCR、real-timePCR(rtPCR)、免疫组化(IHC)和荧光抗体检测(FA)），A型流感病毒(PCR,IHC,FA)、犬呼吸冠状病毒(PCR)和犬瘟热病毒(FA)。甲型流感病毒(H3N8)、副流感病毒、犬腺病毒2号，支气管脓毒症，支气管炎病毒、支原体（spp）均呈阴性。从分离的病毒DNA中扩增出的PCR产物与犬疱疹病毒1型（CaHV-1，167kb）的基因序列同源性为100%•透射电镜观察：肺和MDCK细胞培养上清液检查，肺部有退化细支气管上皮细胞,在细胞核内含有多个100-110nm宽二十面体的病毒颗粒,符合疱疹病毒核衣壳的形状。实验结果鼻甲骨由红到黑呈弥漫性分布，严重出血性鼻炎并伴有坏死、纤维蛋白渗出和出血。肺部有暗红色到紫色的斑点，斑纹，轻微肿胀，质地从柔软、微弹性到咯吱作响。严重的纤维性出血性溃疡性鼻炎伴坏死。鼻黏膜溃疡，固有层扩张，血管、水肿、细胞浸润和出血。鼻甲骨表面渗出物含有纤维蛋白、出血和中性粒细胞严重纤维性出血性支气管间质性肺炎伴有细支气管和肺泡间隔坏死。细支气管上皮和周围肺实质坏死伴有纤维蛋白、水肿、出血和轻度炎症浸润纤维性脓性支气管炎伴支气管上皮坏死或萎缩。支气管粘膜上皮变弱或溃疡。内腔充满纤维素和坏死渗出物支气管上皮坏死或萎缩，比较罕见的出现嗜酸性核内包涵体，在支气管上皮细胞中染色质边缘化检测新鲜肺组织，肺中有退化的细支气管上皮细胞，其中包含100-110纳米宽的二十面体核内病毒颗粒，与疱疹病毒核衣壳，左上角的电子密度线是核包膜，核内的电子密度球状物质是染色质团块，箭头所示为核衣壳。用于病毒分离的MDCK细胞培养上清也含有100-110纳米宽的二十面体病毒核衣壳。讨论•本次实验揭露了一种罕见的CaHV-1感染病例，在成年狗中表现为严重的急性呼吸道疾病。疱疹病毒与宿主共同进化了数百万年，因此宿主适应得非常好，并具有先进的免疫逃避和终生持久性机制。CaHV-1侵袭动物鼻腔粘膜、咽部和扁桃体并，在觉神经节(三叉神经、腰骶神经、前庭神经)或区域淋巴结(咽后淋巴结)的淋巴细胞内寄生，遵循其最初的溶解周期。在大多数情况下，这是终生潜伏期，但当有外界压力的情况下(如传染性气管支气管炎，肿瘤，免疫抑制疾病，长期使用皮质醇药物等)，病毒可以被重新激活，一旦激活，可与细菌或病毒呼吸疾病协同作用共同感染，包括（犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型、犬流感病毒、犬呼吸冠状病毒、犬肺炎病毒、支气管炎）。本研究中提出的病例，从形态学病变与病毒病原学证实了3只死犬为CaHV-1感染，并通过PCR、病毒分离和电子显微镜进一步证实了这一点。进一步的推测，这次暴发可能是由于狗的复发性感染引起的，随后通过直接的接触，交配等方式大量传播。本次实验也可以间接得出结论，CaHV-1是可以感染成年犬，并导致期快速死亡的。讨论•推测，这次暴发可能是由于狗的复发性感染开始的，在压力条件下大量狗的存在可能促进了水平传播。这些数据可能难以解释，因为据报道CaHV-1具有低的序列可变性。23无论如何，这些先前的研究都没有进行尸检以将病变与CaHV-1的存在联系起来。本研究中提出的病例清晰地证实了形态学病变与病毒病原学相一致，并通过PCR、病毒分离和电子显微镜证实了。这一点犬疱疹病毒1是4只成年犬致命的急性呼吸道病毒鼻气管炎和支气管间质性肺炎的可能原因•它的因果关系是由于潜伏的疱疹病毒感染可能是丧失亲人的。这意味着潜在的C