含氮量的测定

第五节含氮量的测定一、概述二、含氮量的测定方法（一）食品中的蛋白质含量在各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同，一般说来动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，例如牛肉中蛋白质含量为20.0%左右，猪肉中为9.5%，兔肉为21%，鸡肉为20%，牛乳为3.5%黄鱼为17.0%，带鱼为18.0%，大豆为40%，稻米为8.5%，面粉为9.9%，菠菜为2.4%，黄瓜为1.0%，桃为0.8%，柑橘为0.9%，苹果为0.4%和油菜为1.5%左右。一、概述（二）测定意义1.蛋白质是组成人体的重要成分之一，人体的一切细胞都由蛋白质组成；2.蛋白质维持体内酸碱平衡；3.蛋白质是食品的重要组织部分之一，也是重要的营养物质；4.蛋白质是评价食品质量高低的指标，还关系到人体健康。一、概述不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白质含氮量为16%，即一份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数。不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。（三）蛋白质换算系数（一）蛋白质测定方法概述测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。二、蛋白质测定方法蛋白质的测定，目前多采用将蛋白质消化，测定其含氮量，再换算为蛋白质含量的凯氏定氮法。不同食品的蛋白质系数有所不同。凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典分析方法，至今仍被作为标准检验方法。凯氏定氮法：常量法、半微量法、微量法及经改进后的改良凯氏定氮法，自动凯氏定氮仪等。微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少，且有一套微量凯氏定氮器目前通用以硫酸铜作催化剂的常量、半微量、微量凯氏定氮法。在凯氏法改良中主要的问题是，氮化合物中氮的完全氨化问题及缩短时间、简化操作的问题，即分解试样所用的催化剂。常量改良凯氏定氮法在催化剂中增加了二氧化钛。（二）凯氏定氮法（国标法）凯氏定氮法通过测定食品中N的含量，再乘以蛋白质系数，就可以得到蛋白质的含量而一般来说，食品中蛋白质的含氮量为16％，所以，测得的含氮量再乘以6.25，就能得到蛋白质的含量。蛋白质含量25.6%16NN1、原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。（二）凯氏定氮法（国标法）过程反应方程2NaOH＋(NH4)2SO4＝2NH3↑＋Na2SO4＋2H2O2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO32NH2(CH)2COOH＋13H2SO4＝(NH4)2SO4＋6CO2＋12SO2＋16H2O2、仪器和试剂（1）500ml凯氏烧瓶（2）定氮蒸馏装置（3）试剂：硫酸铜；硫酸钾；硫酸；含蛋白质试样40g/L硼酸溶液：混合指示剂：（国标）1g/L甲基红乙醇溶液与1g/L甲基蓝乙醇溶液，临用时按2﹕1的比例混合。或者1g/L甲基红乙醇溶液与1g/L溴甲酚绿乙醇溶液，临用时按1﹕5的比例混合；400g/L氢氧化钠；0.1mol/L盐酸标准溶液3、步骤样品消化→蒸馏、吸收→滴定（1）消化准确称取固体样品0.2～2.0g，液体10～20ml，置于500ml凯氏烧瓶中。加入硫酸铜0.5g，硫酸钾10g，浓硫酸20ml，摇匀。置于电炉上，成45度角，小火加热。待泡沫停止后，加大火力，保持微沸，至液体变蓝绿色透明，再继续加热0.5～1h，取下冷却后，小心加入20ml水，转移至1000ml容量瓶，定容。（1）消化2NH2(CH)2COOH＋13H2SO4＝(NH4)2SO4＋6CO2＋12SO2＋16H2O一定要用浓硫酸（98%）（2）蒸馏、吸收按左图连接好装置，塞紧瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶下（瓶中有50ml4％硼酸和混合指示剂）。放松夹子，加入70～80ml氢氧化钠溶液，至瓶中溶液变为深蓝色或产生黑色沉淀，再加入100ml蒸馏水，夹紧夹子，加热蒸馏，至氨全部蒸出（250ml）。2NaOH＋(NH4)2SO4＝2NH3↑＋Na2SO4＋2H2O（3）滴定将上述吸收液用0.1000mol/L盐酸标准溶液直接滴定至蓝色变为微红色即为终点，记录盐酸用量。（4）计算乳制品K=6.38（N=15.7%）小麦粉K=5.79（N=17.6%）动物胶K=5.6（N=18.0%）冰蛋K=6.7（N=14.8%）大豆制品K=6.0（16.7%）K=6.25则（N=16%）K-换称等数100014.0mFcVWW—蛋白质的质量分数，%；c—盐酸标准液的浓度，mol/L；V—试剂滴定消耗标准液量，mL；m—样品质量，g；0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol；F—蛋白质系数，6.25。4、注意事项（1）所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配置。（2）样品应是均匀的，固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。（3）当取样量较大时，如干试样超过5g，可按每可试样5ml的比例增加硫酸用量。（4）如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。（5）样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上，万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。（6）在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下。使氮有损失。（7）消化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢2-3ml，促使氧化。（8）一般消化液呈透明蓝绿色（或蓝色或浅绿色）后继续消化30分钟即可。但对于含有难氨化的含氮化合物样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需要适当延长消化时间。含铁量多时，呈深绿色。（9）加入硫酸钾的作用为升高溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜可作为消化结束时指示剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。（10）蒸馏前如加碱不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需增加氢氧化钠用量。向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用，生成深兰色的结合物[Cu(NH3)4]2+（11）蒸馏装置不能漏气。（12）蒸馏结束时，使冷凝管下端离开液皿，用少量水冲洗冷凝管下端外部，再蒸馏1min，然后关闭热源，否者可能造成吸收液倒吸。（13）氨是否完全蒸馏出来，可用pH试纸试馏出液是否为碱性。（14）吸收液也可以用0.01当量的酸代替硼酸，过剩的酸液用0.01N碱液滴定，计算时，A为试剂空白消耗碱液数，B为样品消耗碱液数，N为碱液浓度，其余均相同。（15）以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。（16）硼酸吸收液的温度不应超过40度，否则对氨的吸收作用减弱，而造成损失，此时可置于冷水浴中使用。（17）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。（三）微量凯氏定氮法1.原理与常量凯氏定氮法相同2.步骤采样（固体采样、液体采样）样品预处理样品分析样品数据处理撰写分析报告（四）自动凯氏定氮仪全自动凯氏定氮仪生产厂家：FOSS福斯产品型号：K2300技术参数：数据储存：200个样品的数据蒸馏时间：3.5分钟/样品(30mg)（仅蒸馏时用）循环时间：4.5分钟/样品(30mg氮)1升/每分钟，15C水温。测定范围：0.1-200毫克氮重现性：1%相对误差（包括消化步骤)回收率：99.5-100%滴定精度：3.8ul/步，最快40ml/分钟试剂体积：0-150ml,10ml/级延时：0-999秒电力供应：220V，50/60HZ仪器主要特点：全新长寿命设计，高级微机智能控制，大荧屏显示，菜单式人机对话操作，高精度（3.8ul/滴）智能调速滴定系统以及全面运行监控系统，采用国家/国际标准法—颜色指示法检测终点，自动化程度高（消化好的样品直接上机自动完成分析和计算全过程），稳定可靠，运行成本低，最大限度地保证操作人员的安全及结果的准确性和精度。检测结果（12种表示法）直接在显示屏显示及打印。内置的计算机可将检测数据向PC机及LIMS系统转移。应用范围：对原料、成品和半成品中的含氮和总氮含量的测定(五)蛋白质的快速测定法传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。新开发的：双缩脲法、紫外分光光度法、染料结合法、水杨酸比色法等。下面简单介绍双缩脲法1.原理脲（尿素）NH2—CO—NH2加热至150~160℃时，两分子缩和成双缩脲。双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应）蛋白质分子中含有肽键—CO—NH—与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（560nm）NH2—CO—NH—CO—NH2+NH3NH2—CO—NH2+NH2—CO—NH2（六）氨基酸含量的测定1.甲醛滴定法2.茚三酮的比色法1.甲醛滴定法（1）原理：氨基酸本身有碱性—NH2—基，又有酸性—COOH基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，甲醛与—NH2—结合，碱性消失，再用强碱来滴定—COOH基。（2）适用范围：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程中氮量减少情况及食品中游离氨基酸的测定等。（3）试剂①40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至蓝色。②0.1%百里酚酞乙醇溶液，③0.1%中性红50%乙醇溶液，④0.1mol/L氢氧化钠标准溶液。（3）操作：同时取两份样：一份中加中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和样液中其它酸性物质。另一份中加百里酚酞、中性甲醛用NaOH滴，中和了样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总和。二者之差可计算氨基酸含量。2.茚三酮的比色法原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，可比色定量。1.薄层色谱法2.氨基酸自动分析仪法3.气相色谱法4.高效液相色谱法（七）氨基酸的分离与测定1.薄层色谱法原理：取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。Rf=a/bab样点溶剂前沿点样原点操作方法：①薄层板制备②样品液制备③点样④展开⑤显色2.氨基酸自动分析仪法3.气相色谱法4.高效液相色谱法思考题：1、试述蛋白质测定中，样品消化过程所必须注意的事项，消化过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？2、样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠？这时溶液发生什么变化？为什么？如果没有变化，说明什么问题？须采用什么措施？3、硫酸铜及硫酸钾在测定中起了什么作用？4、试述氨基酸态氮的测定原理。5、结果计算中为什么要乘上蛋白质系数？